mTOR在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義.pdf

1、前言: 腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占成人原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的50％-60％。在治療上，以手術(shù)治療為主，因腫瘤浸潤性生長，多數(shù)腫瘤與正常腦組織無明確的界限，不能徹底切除，因而術(shù)后多需要進(jìn)行放射治療、化學(xué)治療等多種輔助療法。由于惡性腫瘤的生物學(xué)特性，即使進(jìn)行了綜合治療，腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)幾乎也是不可避免的。TOR(雷帕霉素靶蛋白)最初是1991年在酵母的突變株TOR1-1和TOR2-1中被發(fā)現(xiàn)。1994年，Bro

2、wn等證實(shí)并克隆了哺乳動物TOR基因，其產(chǎn)物只有一種蛋白，即mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，也被稱為FRAP、RAFT、RAPT)。人mTOR基因定位于1p36.2，編碼的蛋白質(zhì)由2549個氨基酸組成，分子量是280kDa。研究表明mTOR在細(xì)胞的增殖、生長、分化過程中起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用。此外，相關(guān)研究證實(shí)其在腫瘤的形成、發(fā)展過程，也起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以及westem blot的方法探討mTO

3、R的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度或組織學(xué)分級的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)材料: 選擇選取中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院神經(jīng)外科2006年12月至2007年6月間手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本35例，其中男21例，女14例，年齡20～74歲，平均年齡46歲。根據(jù)WHO(2001年)關(guān)于人腦膠質(zhì)瘤病理分類方法：包括Ⅰ級6例，Ⅱ級15例，Ⅲ級9例，Ⅳ級5例。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他任何可能對腫瘤生物學(xué)特性的干預(yù)性治療。 主要試劑：P

4、CR引物(大連寶生物公司)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(大連寶生物公司)；硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)；兔抗人mTOR(美國Biochemicals公司)；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京中山公司)；鼠抗β-actin(美國Sigma公司)等。 主要儀器：高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3C15K美國)；PCR儀(Biometra Unio Ⅱ型，德國)；多功能電泳儀(北京六一儀器廠)；紫外分光光度計(jì)(UV3000,英國)；凝

5、膠自動成像及分析系統(tǒng)(Chemi Imager,美國)；轉(zhuǎn)印電泳槽(北京六一儀器廠)等。 實(shí)驗(yàn)方法: 1、RT-PCR采用Trizol試劑一步法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測定純度并定量。根據(jù)GenBank提供的mTOR和內(nèi)參照β-actin的mRNA序列，應(yīng)用軟件Primer Premier5.0自行設(shè)計(jì)引物。反應(yīng)條件：94℃ 5min，一個循環(huán)；94℃，30s,55℃ 30 s,72℃1min，35個循環(huán)；72℃

6、 5min后結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，120V,30min，電泳結(jié)束后，凝膠成像儀成像分析。 2、Western blot提取樣品蛋白，進(jìn)行樣品蛋白定量并進(jìn)行濃度調(diào)整，電泳，轉(zhuǎn)印，用抗mTOR抗體和抗β-actin抗體孵育，最后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，加入顯色劑顯色后記錄結(jié)果，并用凝膠成像儀分析圖像。 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，mTOR基因的表達(dá)值以(mT

7、OR的光密度值/β-actin吸光度值)×100％表示，結(jié)果以-x±s表示。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩樣本率的比較用X2檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 本研究結(jié)果顯示：30例人腦膠質(zhì)瘤樣本中有mTOR的mRNA以及蛋白的表達(dá)，Ⅰ級，Ⅱ級，Ⅲ級，Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中mTOR的表達(dá)率無顯著性差異。隨腫瘤惡性程度的增高mTOR的mRNA以及蛋白的表達(dá)均有所增高，Ⅰ級，Ⅱ級，Ⅲ級

8、，Ⅳ級膠質(zhì)瘤中組織中mTOR的mRNA以及蛋白表達(dá)值相互比較，差異顯著。 討論: 膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，很多基礎(chǔ)研究期望從基因水平尋求治療膠質(zhì)瘤的突破口。mTOR是近年來發(fā)現(xiàn)的一類進(jìn)化上非常保守的蛋白激酶家族，廣泛存在于各種生物細(xì)胞中。最近對其復(fù)合物功能的研究對腫瘤和代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制提供了合理的解釋。既往研究表明，在多數(shù)腫瘤組織中mTOR高表達(dá)，如前列腺癌、乳腺癌、肝癌、腮腺癌、膽管癌以及白血病等。以上研究結(jié)果提

9、示mTOR高表達(dá)可能與腫瘤形成和細(xì)胞增殖活躍密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR在人腦膠質(zhì)瘤組織中基因及蛋白水平的表達(dá)值增高，并且隨腫瘤惡性程度的增高mTOR的mRNA以及蛋白的表達(dá)值均有所增高，Ⅰ級，Ⅱ級，Ⅲ級，Ⅳ級膠質(zhì)瘤中組織中mTOR的mRNA以及蛋白表達(dá)值相互比較，差異顯著。雷帕霉素及其衍生物作為mTOR特異性抑制劑在腫瘤治療中的作用已引起廣泛關(guān)注，其中關(guān)于前列腺癌、乳腺癌、胃腸道間質(zhì)的腫瘤治療研究已進(jìn)入Ⅰ期