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文檔簡介
1、脊髓損傷是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病,發(fā)病率極高。結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)是脊髓損傷后治療的關(guān)鍵。一方面由于脊髓損傷后的再生能力極其有限,另一方面對脊髓再生的調(diào)控缺乏足夠的認識,脊髓損傷的治療成為多年來困擾醫(yī)學(xué)界的一大難題。 SCI后所引發(fā)的一系列原發(fā)和繼發(fā)性損傷的細胞學(xué)及分子學(xué)級聯(lián)反應(yīng),對機體產(chǎn)生嚴(yán)重后果。長期以來,人們不斷探索脊髓損傷后神經(jīng)功能永久喪失的復(fù)雜機理及相應(yīng)治療方法,并取得了令人振奮的成果。阻斷細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)可以最大
2、限度地減少細胞凋亡,保護幸存細胞,改善神經(jīng)功能,從而達到有效的治療措施。 近年來,銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B,GB)的神經(jīng)保護作用越來越受到重視。研究表明,GB可能具有類似生長因子的作用,促進神經(jīng)細胞的自然生長,并且在許多病理情況下還能減輕神經(jīng)細胞的損傷和凋亡,發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護作用。本課題用E14-17天的胚胎大鼠脊髓進行神經(jīng)細胞培養(yǎng),通過顯微測量、免疫組化染色方法研究了銀杏內(nèi)酯B對胚胎大鼠脊髓神經(jīng)元以及星形
3、膠質(zhì)細胞、膽堿能神經(jīng)元生長發(fā)育的影響。海人藻酸(kainic acid,KA)是興奮性毒素的一種,被經(jīng)常在體內(nèi)體外試驗中用來探索興奮性氨基酸引起細胞死亡的機制。因此,本工作以KA造成體外脊髓神經(jīng)細胞損傷模型,用免疫組化、熒光染色等方法觀察GB在其中的保護作用并初步探討其保護作用的機制,為臨床應(yīng)用GB有效治療脊髓損傷提供理論及實驗依據(jù)。 實驗結(jié)果如下: 一.GB和NGF促進體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞生長發(fā)育的研究
4、 1.正常體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞的生長發(fā)育情況 用E14-1 7天的胚胎Wistar大鼠脊髓神經(jīng)組織制成的單細胞懸液接種于培養(yǎng)板后,在倒置相差顯微鏡下觀察活細胞胞體呈圓形,無突起。在培養(yǎng)12~24h后觀察可見大部分細胞貼壁,形態(tài)變得扁平,胞體呈橢圓形,周圍出現(xiàn)光暈,并伸出突起。培養(yǎng)3天時對照組平均神經(jīng)細胞數(shù)量為58.5+5.30個/視野,培養(yǎng)7天和10天后,分別降至31.50±2.02和20.00+1.97。活
5、細胞顯微測量顯示:培養(yǎng)3天和7天時胞體平均直徑分別為8.18+0.821μm和11.62±1.031μm,平均每細胞的突起數(shù)分別為1.42±0.11和1.78+0.15,最長突起長度分別為16.28±1.071μm和83.62±9.73μm。培養(yǎng)第七天,對培養(yǎng)的細胞行NSE免疫組化染色結(jié)果顯示:陽性細胞數(shù)為28.00+1.75個/視野,胞體平均面積為182.78±27.23,平均每細胞的突起數(shù)為1.68±0.32個,最長突起長度為72.
6、53±7.92μm。GFAP免疫組化染色結(jié)果顯示:陽性細胞數(shù)為7.05±0.82個/視野,胞體平均面積為860.86±97.62,平均每細胞的突起數(shù)為2.95±0.76個。AChE組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:陽性細胞數(shù)為110.50±10.80個/cm<'2>,胞體平均面積為200.25±18.54,平均每細胞的突起數(shù)為1.95±0.14個,最長突起長度為88.59±7.95μm。 2.NGF促進體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞的生長發(fā)
7、育 NGF是最早發(fā)現(xiàn)的細胞生長調(diào)節(jié)因子,也是迄今為止研究得最清楚的一個神經(jīng)營養(yǎng)因子。本實驗中培養(yǎng)液同時加入NGF(50 μg/L),用以作為陽性對照組。通過顯微測量、NSE、GFAP免疫組織化學(xué)染色及AChE酶組織化學(xué)染色的方法,觀察NGF對體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞、NSE陽性神經(jīng)元、GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞及AChE陽性膽堿能神經(jīng)元生長發(fā)育的影響。 鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與正常體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞相比,NGF
8、組神經(jīng)細胞數(shù)目較多,分布均勻,神經(jīng)細胞胞體大而飽滿,有光暈,呈圓形,突起較長。培養(yǎng)3天、7天和10天,NGF組平均神經(jīng)細胞數(shù)量分別為69.00±6.14、39.00±2.34和29.00±2.03,較對照組數(shù)量均顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05)?;罴毎@微測量顯示:培養(yǎng)3天和7天時胞體平均直徑分別為10.28±1.01μm和15.58±1.28μm,較對照組顯著增多(P<0.05,P<0.05)。平均每細胞的突起數(shù)分
9、別為2.31±0.2l和3.12±0.28個,較對照組非常顯著增多(P<0.01,P<0.01)。最長突起長度分別為21.95±2.01μm和102.59±10.03μm,較對照組顯著增多(P<0.05,P<0.05)。 NGF組NSE陽性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細胞突起數(shù)量和平均最長突起長度分別為36.00±2.18個/視野、223.254±33.54、2.31±0.35個/細胞和89.754±8.24μm,較對照組顯
10、著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05)。GFAP陽性神經(jīng)細胞數(shù)、胞體平均面積和平均每細胞突起數(shù)量分別為9.05±0.95個/視野、1012.364±130.19和3.954±0.82個/細胞,較對照組顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。AChE陽性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細胞突起數(shù)量和平均最長突起長度分別為214.00±20.10個/cm<'2>、400.844±39.46、5.15±0
11、.45個/細胞和124.23±11.59μm,較對照組顯著增多(P<0.05)。 結(jié)果提示:NGF能夠促進體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞的存活,促進神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及膽堿能神經(jīng)元的成熟及分化,促進其細胞胞體及突起的生長。 3.GB促進體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞的生長發(fā)育 近年來的研究表明,GB可能具有類似生長因子的作用,促進神經(jīng)細胞的自然生長,但是,以上研究大多在皮層、海馬、紋狀體等處進行,對于
12、GB在脊髓中作用中的研究較少。本實驗中培養(yǎng)液同時加入GB(40μg/L),通過顯微測量、NSE、GFAP免疫組織化學(xué)染色及AChE酶組織化學(xué)染色的方法,觀察GB對體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞、NSE陽性神經(jīng)元、GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞及AChE陽性膽堿能神經(jīng)元生長發(fā)育的影響。 鏡下觀察發(fā)現(xiàn),GB處理組細胞密度較對照組大,胞體增大,呈梭形、圓形或多角形,突起較長且粗。培養(yǎng)3天時GB組平均神經(jīng)細胞數(shù)量為68.50±5.96個
13、/視野,培養(yǎng)7天和10天后,分別為38.50±2.26和28.00±2.15,較對照組數(shù)量均顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05)?;罴毎@微測量顯示:培養(yǎng)3天和7天時胞體平均直徑分別為10.05±1.04μm和15.26±1.03μm,較對照組顯著增多(P<0.05,P<0.05)。平均每細胞的突起數(shù)分別為2.48±0.23和3.26±0.31個,較對照組非常顯著增多(P<0.01,P<0.01)。最長突起長度分別為22
14、.68±2.11μm和148.724±13.99μm,較對照組顯著增多(P<0.05,P<0.01);其中,培養(yǎng)第7天GB組神經(jīng)細胞最長突起長度較NGF組亦顯著增多(P<0.05)。 GB組NSE陽性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細胞突起數(shù)量和平均最長突起長度分別為35.50±2.05個/視野、201.16±32.42、2.56±0.43個/細胞和138.96±14.20μm,較對照組顯著增多(P<0.05,P<0.05
15、,P<0.01,P<0.01),其中,GB組最長突起長度較NGF組亦顯著增多(P<0.05)。GFAP陽性神經(jīng)細胞數(shù)、胞體平均面積和平均每細胞突起數(shù)量分別為9.45±1.03個/視野、994.76±112.34和4.05±0.91個/細胞,較對照組顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。AChE陽性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細胞突起數(shù)量和平均最長突起長度分別為210.00±19.61個/cm<'2>、300.15±32
16、.59、5.95±0.61個/細胞和164.54±15.741.Tm,較對照組顯著增多(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01)。其中,GB組最長突起長度較NGF組亦顯著增多(P<0.05)。 結(jié)果提示:GB能夠促進體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞的存活,促進神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及膽堿能神經(jīng)元的成熟及分化,促進其細胞及突起的生長。其促進脊髓神經(jīng)細胞、NSE、GFAP、AChE陽性細胞的存活、胞體及突起發(fā)育的作用與NGF
17、一致,而其促進神經(jīng)突起分化與生長的作用強于NGF。 二.GB和MK-801保護體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞免受KA細胞毒性作用的研究 1.KA對體外培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞的毒性作用 KA是興奮性神經(jīng)毒素的一種,被經(jīng)常在體內(nèi)體外試驗中用來探索興奮性氨基酸引起細胞死亡的機制。因此,本工作以KA造成體外脊髓神經(jīng)細胞損傷模型,用顯微測量、免疫組化、熒光染色等方法觀察KA的細胞毒性作用并初步探討其毒性作用的機制
18、。 培養(yǎng)第五天加入損傷性藥物KA(100μM),24小時后鏡下觀察,細胞貼壁不良,輪廓界線不清,折光性差,部分細胞胞體內(nèi)出現(xiàn)空泡,突起斷裂呈串珠樣,部分細胞突起消失。損傷組存活細胞數(shù)為19.95±1.46個/視野,與對照組組相比非常顯著減少(P<0.01)。胞體平均直徑為9.57±1.24μm,平均每細胞突起數(shù)量為0.85±0.12,平均最長突起長度為20.05±1.54μm,均顯著小于對照組(P<0.01,P<0.01,P<0
19、.01)?!?KA損傷組NSE陽性神經(jīng)元數(shù)、胞體平均面積、平均每細胞突起數(shù)量和平均最長突起長度分別為13.85±1.04/視野,104.52±14.24,0.91±0.14個/細胞和20.12±1.56μm,與對照組相比均非常顯著性減少(P<0.01)。GFAP星形膠質(zhì)細胞數(shù)、胞體平均面積和平均每細胞突起數(shù)量分別為2.50±0.38/視野、582.96±55.37和0.92±0.13個/細胞,均非常顯著小于對照組(P<0.01)。
20、加入損傷性藥物后進行細胞化學(xué)染色,KA損傷組Hoechst 33258熒光陽性細胞數(shù)量和cleavedcaspase-3陽性細胞數(shù)量均非常顯著大于對照組(P<0.01,P<0.01)。結(jié)果提示:KA能夠?qū)w外培養(yǎng)大鼠脊髓神經(jīng)細胞造成損傷,表現(xiàn)為降低神經(jīng)細胞的存活,減少細胞體、突起數(shù)及最長突起的生長與發(fā)育;還可以引起細胞核染色質(zhì)固縮,活化caspase3,導(dǎo)致細胞凋亡。 2.MK-801對KA損傷胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞生長的保護作
21、用 研究表明,KA的興奮性毒性作用中有著NMDA受體的介導(dǎo)。本實驗應(yīng)用NMDA受體拮抗劑MK-801作為陽性對照組,利用顯微測量、免疫組化、熒光染色等方法,觀察了MK-801對KA損傷胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞生長的保護作用并初步探討其保護作用的機制。 細胞培養(yǎng)第5天加入MK-801,6小時后加入KA,24小時后,MK-801+KA組細胞存活數(shù)、平均每細胞突起數(shù)量和平均最長突起長度分別為25.05+1.73個/視野、1.3
22、2±0.30個/細胞和58.62±6.431μm,與對照組組相比顯著減少(P<0.05,P<0.05,P<0.05),與KA組相比顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。胞體平均直徑為10.59±1.51μm,較對照組無顯著差異(P>0.05),與KA組相比顯著增多 (P<0.05)。 MK-801+KA組存活NSE陽性神經(jīng)元數(shù)、平均每細胞突起數(shù)量和平均最長突起長度分別為20.05+1.91個/視野、1.35±0
23、.31個/細胞和58.024±6.85μm,與對照組組相比顯著減少(P<0.05,P<0.05,P<0.05),與KA組相比顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05);胞體平均面積為145.27±19.54,較對照組無顯著差異(P>0.05),與KA組相比顯著增多(P<0.05)。GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞數(shù)、胞體平均面積和平均每細胞突起數(shù)量分別為4.90±0.60個/視野、748.84±70.02和1.25±0.26/細胞,與
24、對照組組相比顯著減少(P<0.05,P<0.05,P<0.05),與KA組相比顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。Hoechst 33258凋亡陽性細胞數(shù)量以及cleaved-caspase3陽性細胞數(shù)量與對照組相比均顯著增多(P<0.05,P<0.05),與KA組相比均顯著減少(P<0.05,P<0.05)。 結(jié)果提示:MK-801對KA誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)細胞興奮性損傷有保護作用。其促進脊髓神經(jīng)細胞、NSE、G
25、FAP陽性細胞的存活,對胞體及突起有一定的保護作用。該神經(jīng)保護作用與其可以抑制caspase-3活化、減少神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。3.GB對KA損傷胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞生長的保護作用 研究表明,GB在許多病理情況下能減輕神經(jīng)細胞的損傷和凋亡,發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護作用。本實驗中用顯微測量、免疫組化、熒光染色等方法,觀察了GB對KA損傷胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞生長的保護作用,并初步探討了其作用機制。 細胞培養(yǎng)第5天加入GB,6小時后加
26、入KA,24小時后,存活細胞數(shù)、平均每細胞突起數(shù)量和平均最長突起長度分別為為24.354±1.67個/視野、1.294±0.25個/細胞和56.46±6.03μm,與對照組組相比顯著減少(P<0.05,P<0.05,P<0.05),與KA組相比顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。胞體平均直徑為10.484±1.45μm,較對照組無顯著差異(P>0.05),與KA組相比顯著增多(P<0.05)。 GB+KA組NS
27、E陽性神經(jīng)元存活數(shù)量、平均每細胞突起數(shù)量和平均最長突起長度分別為為20.25±2.01/視野、1.31±0.27個/細胞和57.35±6.12μm,與對照組組相比顯著減少(P<0.05,P<0.05,P<0.05),與KA組相比顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05);胞體平均面積為142.124±15.21,較對照組無顯著差異(P>0.05),與KA組相比顯著增多(P<0.05)。GB+KA組GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞數(shù)、胞
28、體平均面積和平均每細胞突起數(shù)量分別為4.40±0.63個視野、751.24±69.28和1.24±0.22個/細胞,與對照組組相比顯著減少(P<0.05,P<0.05,P<0.05),與KA組相比顯著增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。Hoechst 33258凋亡陽性細胞數(shù)量以及cleaVed-caspase3陽性細胞數(shù)量與對照組相比均顯著增多(P<0.05,P<0.05),與KA組相比均顯著減少(P<0.05,P<0.
29、05)。 結(jié)果提示:GB具有減輕KA引起的體外培養(yǎng)大鼠胚胎脊髓神經(jīng)細胞興奮性損傷的保護作用,具體表現(xiàn)為促進脊髓神經(jīng)細胞、NSE、GFAP陽性細胞的存活,防止GB對神經(jīng)細胞胞體及突起的損傷,該作用與抑制caspase-3活化和減少神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。 綜上所述,本實驗研究得出以下結(jié)論: (1)GB促進體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞的存活和生長發(fā)育。 (2)GB促進脊髓神經(jīng)細胞、NSE、GFAP、AChE陽性細
30、胞的存活、胞體及突起發(fā)育的作用與NGF一致,而其促進神經(jīng)突起分化與生長的作用強于NGF。(3)GB能夠減輕KA誘導(dǎo)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞興奮性損傷。其促進脊髓神經(jīng)細胞、NSE、GFAP陽性細胞的存活,對細胞胞體及突起分化和生長的保護作用與MK-801一致。 (4)GB的神經(jīng)保護作用與其抑制caspase-3活化、減少神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。 總之,本實驗旨在探討GB促進體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細胞生長發(fā)育及其神經(jīng)保護作
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