三磷酸腺苷誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、腦創(chuàng)傷是神經(jīng)科的常見(jiàn)疾病，發(fā)病率極高，目前人們已經(jīng)清楚其病理學(xué)改變包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段，由于原發(fā)性損傷的不可逆性，采取多種手段減輕繼發(fā)性損傷，促進(jìn)腦損傷及其周?chē)鷧^(qū)神經(jīng)細(xì)胞的存活和功能恢復(fù)，對(duì)于改善病人的預(yù)后非常重要。目前研究證實(shí)中樞神經(jīng)繼發(fā)性損傷的發(fā)病機(jī)制主要是：由腦損傷區(qū)局部水腫、缺血、缺氧，電解質(zhì)紊亂，自由基和過(guò)氧化脂質(zhì)的生成，興奮性氨基酸、炎性因子和一氧化氮的毒性作用等所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死。近期有研究證實(shí)在中樞

2、神經(jīng)損傷后損傷周?chē)鷧^(qū)出現(xiàn)高濃度的三磷酸腺苷(ATP)聚集，并參與繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死。ATP是傳統(tǒng)的能量物質(zhì)，在細(xì)胞線(xiàn)粒體產(chǎn)生，釋放到胞漿內(nèi)發(fā)揮作用。正常情況下細(xì)胞外含量很低。Wang xiaohai報(bào)道在脊髓損傷后ATP在損傷周?chē)鷧^(qū)存在高濃度聚集，誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Chen ming研究證實(shí)腦外傷后，損傷周?chē)鷧^(qū)．ATP P2X<,1>、P2X<,4>、P2X<,7>受體表達(dá)上調(diào)，ATP通過(guò)作用于小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的P2X離子通道型

3、受體，使小膠質(zhì)細(xì)胞活化釋放炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子繼而引起神經(jīng)元損傷。在缺血或缺氧等病理?xiàng)l件下，嘌呤核苷酸也會(huì)從死亡細(xì)胞中釋放至細(xì)胞外并達(dá)到高濃度，如Franke將大腦皮質(zhì)腦片在低氧條件(95﹪N<,2>,5﹪CO<,2>)下培養(yǎng)30分鐘，可引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，若提前加入ATPP2X受體阻斷劑PPADS，則可阻止細(xì)胞死亡，提示P2受體參與了此過(guò)程。ATP及P2受體也參與并介導(dǎo)了神經(jīng)元退行性疾病。阿耳茨海默(氏)病(AD)是一種細(xì)胞外β淀粉樣

4、肽類(lèi)物質(zhì)的進(jìn)行性沉積過(guò)程，可以引起神經(jīng)元的損傷最終導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂而死亡。ATP鋁鹽能促進(jìn)β淀粉樣蛋白的形成，這一反應(yīng)可以被ATP受體阻斷劑suramin阻斷。ATP還可以調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。ATP通過(guò)作用于P2Y受體，促進(jìn)從黑質(zhì)致密部投射到紋狀體的神經(jīng)末稍釋放多巴胺。以上研究證實(shí)ATP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用，然而目前有關(guān)ATP對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性損傷后神經(jīng)細(xì)胞作用的報(bào)道并不一致，其病理生理學(xué)

5、機(jī)制也不十分清楚。我們推測(cè)ATP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞作用的多樣復(fù)雜性與其作用濃度，以及通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。另外，ATP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷可能通過(guò)兩種方式即直接損傷與間接損傷進(jìn)行。直接損傷是指ATP通過(guò)直接作用于神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表面的受體造成神經(jīng)細(xì)胞的死亡；間接損傷是ATP首先作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞表面的受體，造成小膠質(zhì)細(xì)胞活化，釋放大量炎性因子，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞死亡。通過(guò)上述兩條途徑ATP參與了中樞神經(jīng)損傷的繼發(fā)性損傷過(guò)程

6、。因此深入細(xì)致研究?jī)?nèi)、外源性ATP對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育和損傷修復(fù)中的作用、分子機(jī)制和防治措施具有重要的醫(yī)學(xué)理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。 本工作在體外培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?，?yīng)用顯微鏡觀察、MTT細(xì)胞活性測(cè)定、NSE和cleaved caspase-3免疫細(xì)胞化學(xué)，以及hoechst熒光細(xì)胞化學(xué)染色等方法，著重研究ATP直接導(dǎo)致胚胎大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞死亡作用的劑量和時(shí)間依賴(lài)性，初步證實(shí)了活化的caspase-3參與AT

7、P致細(xì)胞死亡的機(jī)制，并探討了ATP P2受體阻斷劑蘇拉明(suramin)及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在ATP致神經(jīng)細(xì)胞損傷后增加細(xì)胞存活率的神經(jīng)保護(hù)作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 一、不同濃度ATP對(duì)培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的作用及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的劑量依賴(lài)性本工作利用倒置顯微鏡觀察、MTT細(xì)胞活性測(cè)定和NSE免疫細(xì)胞化學(xué)的方法，研究了不同濃度．ATP溶液對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞活性、形態(tài)學(xué)以及NSE陽(yáng)性神經(jīng)元的影響

8、。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)不同濃度．ATP(0.1、1、5、10、100 mmol/L)．溶液作用于細(xì)胞12 h，MTT法測(cè)定細(xì)胞活性分別為正常對(duì)照組的102﹪、100﹪、73﹪、59﹪、34﹪。5、10、100 mmol/LATP組細(xì)胞存活率較對(duì)照組相比，存在顯著性差異(P<0.05)。 (2)上述不同濃度ATP溶液作用于細(xì)胞24 h，倒置顯微鏡下觀察大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和活細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，正常生長(zhǎng)的大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞呈

9、橢圓形，胞體飽滿(mǎn)，邊界清晰，周?chē)泄鈺?，?xì)胞之間形成網(wǎng)狀的突觸聯(lián)系，活細(xì)胞數(shù)量為73.91±7.162個(gè)；0.1mmol/L，ATP組活細(xì)胞計(jì)數(shù)為74.20±4.022個(gè)，其細(xì)胞形態(tài)學(xué)與正常對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異；5 mmol/LATP組細(xì)胞數(shù)量減少，活細(xì)胞計(jì)數(shù)為35.45±5.410個(gè)，同時(shí)細(xì)胞體積減小，多呈圓球狀，突起斷裂，細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系明顯減少；10 mmol/L ATP組細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)減少，活細(xì)胞計(jì)數(shù)為30.10±5.724

10、.個(gè)，突起斷裂，死亡細(xì)胞碎片聚集成團(tuán)；100 mmol/L ATP組活細(xì)胞計(jì)數(shù)為19.90±1.633個(gè)，死亡細(xì)胞碎片繼續(xù)增多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，5、10、100 mmol/L ATP活細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較存在非常顯著性差異(P<0.01)。 (3)不同濃度.ATP溶液作用于細(xì)胞24 h，NSE陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)呈濃度依賴(lài)性減少，對(duì)照組為72.80±7.099個(gè)，0.1、5、10、100 mmol/L ATP溶液組NSE陽(yáng)性神經(jīng)元分

11、別為75.00±6.667個(gè)、31.14±7.574個(gè)、26.00±6.716個(gè)、15.20±3.824個(gè)。 5、10、100 mmol/L ATP組與對(duì)照組相比，存在非常顯著性差異(P<0.01)。以上結(jié)果提示5、10、100 mmol/L ATP溶液可以呈劑量依賴(lài)性地導(dǎo)致體外培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞死亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、聚集成團(tuán)和突起斷裂。 二、不同濃度ATP對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的作用我們應(yīng)用倒置顯微鏡觀

12、察和NSE免疫細(xì)胞化學(xué)的方法研究了不同濃度ATP溶液對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)以及NSE陽(yáng)性神經(jīng)元的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)不同濃度ATP(0.1、10、100 mmol/L)溶液作用于細(xì)胞24 h，顯微鏡下活細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示：對(duì)照組為56.94±3.60個(gè)，0.1、10、100 mmol/L ATP溶液作用組為58.20±3.40個(gè)、32.45±1.31個(gè)、17.89±1.63個(gè)。10、100 mmol/L ATP溶

13、液作用組與對(duì)照組相比，存在非常顯著性差異(P<0.01)。 (2)不同濃度0.1、10、100 mmol/L ATP溶液作用于細(xì)胞24 h，計(jì)算NSE陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組為54.64±5.61個(gè)，0.1、10、100 mmol/L ATP溶液作用組為55.00±6.67個(gè)、36.64±9.83個(gè)、17.28±4.89個(gè)。 10、100 mmol/L ATP作用組與對(duì)照組相比，存在非常顯著性差異(P<0.01)。以上結(jié)

14、果提示10、100 mmol/L ATP溶液可以呈劑量依賴(lài)性地導(dǎo)致體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞死亡。 三、凋亡蛋白caspase-3活化機(jī)制參與ATP致體外培養(yǎng)的胚鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程細(xì)胞死亡包括壞死和凋亡兩種方式。為探討ATP致胚胎大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞死亡的性質(zhì)，我們進(jìn)行了Hoechst 33258熒光細(xì)胞化學(xué)染色。Hoechst 33258是一種親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞與富含AT區(qū)的DNA特異性結(jié)合。用紫外光作為激發(fā)光

15、，被標(biāo)記的正常DNA發(fā)出朦朧藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞由于染色質(zhì)凝聚呈亮而致密的熒光。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞培養(yǎng)第5 d，培養(yǎng)液中加入5、10、100 mmol/L ATP作用皮層神經(jīng)細(xì)胞6 h，Hoechst 33258凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在200倍視野下對(duì)照組為5.00±2.617個(gè)，5、10、100 mmol/L ATP溶液作用組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為14.00±2.927個(gè)、22.00±6.880個(gè)、26.20±9.576個(gè)，與對(duì)照組間存在非常

16、顯著性差異(P<0.01)。提示ATP可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 四、ATP P2受體調(diào)制ATP誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的胚鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞死亡中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在著ATP受體。目前發(fā)現(xiàn)的ATP受體主要有P2X和P2Y兩個(gè)亞型。P2X為離子通道型受體，P2Y是G蛋白偶聯(lián)代謝型受體。目前P2X受體亞型在哺乳動(dòng)物已克隆出7種，為P2X<,1-7>,P2Y受體克隆出8種，為P2Y<,1，2，4，6，11，12，13，14>。sur

17、amin是一種水溶性的化合物，其分子式為C51H34N6O23Na6S6，分子量為1429。研究表明，suramin能夠拮抗P2X受體的作用，也可拮抗除P2Y4外多數(shù)P2Y受體。 以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出下面結(jié)論： 1. 中、高濃度ATP可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層和脊髓神經(jīng)細(xì)胞死亡。 2．細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3活化參與ATP誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程。 3．ATP P2受體