鴨腸炎病毒部分基因結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能的初步研究.pdf

1、鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis,DVE),又名鴨瘟(Duck plague,DP),是由鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病,曾在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生流行,給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失.DEV是皰疹病毒科成員,第八次病毒分類報(bào)告將其劃分為皰疹病毒科未分類病毒.由于DEV分子生物學(xué)研究相對(duì)滯后,其基因組組成和結(jié)構(gòu)未知,在很大程度上限制了

2、DEV致病機(jī)制及該病在防控方面的研究. 本研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室提交至GenBank上的DEV clone-03部分基因組序列,選擇在皰疹病毒中較為保守的囊膜蛋白UL27、主要衣殼蛋白UL19以及在絕大多數(shù)皰疹病毒成員基因組排列中保守的基因簇(UL22-FK.UL-24)進(jìn)行測(cè)序.選取同源性較高的α-皰疹病毒同源蛋白作為參考毒株,應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)5個(gè)基因進(jìn)行序列比對(duì),分析各個(gè)基因編碼蛋白的保守區(qū).結(jié)果表明,DEV clone-

3、03 UL19和UL27保守,UL22次之,TK具有胸苷激酶特征性結(jié)構(gòu)域:ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域.與HSV-1相似,UL24也存在5個(gè)保守位點(diǎn).UL22和UL27編碼的蛋白具有跨膜糖蛋白典型特征,UL22具有7個(gè)糖基化位點(diǎn),6個(gè)跨膜區(qū),在N末端1～21位氨基酸為信號(hào)肽序列,符合皰疹病毒gH糖蛋白的特點(diǎn);UL27有9個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),3個(gè)跨膜區(qū),符合皰疹病毒gB糖蛋白的特點(diǎn).此外,根據(jù)5個(gè)基因編碼氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

4、,發(fā)現(xiàn)DEV clone-03與馬立克病毒屬親緣關(guān)系較近,但又形成獨(dú)立分支.根據(jù)這5個(gè)基因比較結(jié)果,建議將鴨腸炎病毒歸類為皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科. 為了鑒定DEV clone-03結(jié)構(gòu)基因,將DEV clone-03 UL19基因分成UL19-N、UL19-M、UL19-C三段進(jìn)行原核表達(dá)并制備抗血清.同時(shí)表達(dá)UL27基因中段UL27-M和UL6基因的UL6-1和UL6-2二段,應(yīng)用Western blot和間接免疫熒光方

5、法檢測(cè)6個(gè)重組蛋白的單因子血清與DEV clone-03全病毒的反應(yīng)性.結(jié)果表明UL19-N、UL19-M和UL19-C三段蛋白制備的抗血清均能夠與全病毒發(fā)生特異性反應(yīng),在大約150kDa處檢測(cè)到特異性蛋白條帶,大小與DNAStar軟件預(yù)測(cè)的DEV clone-03 UL19蛋白大小一致,說(shuō)明:DEV clone-03 UL19是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,大小約為150kDa,結(jié)合與其他皰疹病毒同源蛋白共有的保守區(qū),初步認(rèn)為DEV clone-0

6、3 UL19可能是病毒的衣殼蛋白.應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)UL27,未能夠在DEV clone-03中檢測(cè)到預(yù)期大小的蛋白條帶,但是,應(yīng)用間接免疫熒光方法檢測(cè),UL27-M抗血清能夠與全病毒發(fā)生抗原抗體反應(yīng),說(shuō)明DEV clone-03 UL27是病毒的組成成分,結(jié)合與其他皰疹病毒同源蛋白共有的保守區(qū),以及UL27具有跨膜糖蛋白特征,推測(cè).DEV clone-03 UL27可能是病毒的囊膜糖蛋白.應(yīng)用UL6-2蛋白抗血清檢測(cè)

7、DEV全病毒,在大約88kDa處檢測(cè)到特異性蛋白條帶,與DNAStar軟件預(yù)測(cè)DEV clone-03 UL6蛋白大小一致,結(jié)合其他研究報(bào)道,初步認(rèn)為DEV clone-03 UL6是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白. 文中應(yīng)用DNAStaz軟件對(duì)上述檢測(cè)抗原性較好的DEV clone-03 UL19蛋白從蛋白的親水性、抗原性以及表面可及性進(jìn)行表位預(yù)測(cè),三段蛋白均存在抗原表位優(yōu)勢(shì)區(qū),因此選取UL19-C段蛋白制備單克隆抗體,擬對(duì)UL19抗原表位進(jìn)

8、行初步定位.將UL19-C蛋白作為抗原免疫6-8周齡的BALB/c小鼠,制備單克隆抗體,經(jīng)過(guò)3次克隆,分別采用間接EIASA、Western blot和間接免疫熒光方法篩選,最后得到4株(185、3A1、4F9、6F6)穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株.將DEV clone-03UL19-C分成兩段進(jìn)行表達(dá),N端命名為ULl9-C1、C端命名為UL19-C2,二者有16個(gè)氨基酸的重疊.Western blot檢測(cè),4株單克隆抗體均能夠識(shí)別UL