腸炎沙門菌lpfC和stdB基因缺失株的構(gòu)建及其相關(guān)功能的初步研究.pdf

1、腸炎沙門菌(Salmonella Enteritidis, SE)是革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生菌，主要寄生在人和動物的腸道內(nèi)，可引起胃腸炎甚至嚴(yán)重的全身性感染，是重要的人獸共患病病原菌。腸炎沙門菌有周身鞭毛和菌毛，可以運動。菌毛可以調(diào)節(jié)細(xì)菌與宿主的相互作用，與細(xì)菌的致病性、生物膜的形成、運動性、黏附和腸道定殖有關(guān)，同時也是腸炎沙門菌中重要的毒力因子之一。在本實驗室前期研究中，利用SCOTS技術(shù)在篩選和鑒定腸炎沙門菌感染RAW264.7和HD-

2、11巨噬細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn):lpfC和stdB基因在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于體外培養(yǎng)狀態(tài)，這兩個基因分別屬于Lpf長極性菌毛操縱子和Std菌毛操縱子家族，但國內(nèi)外對兩基因的功能研究鮮有報道。本研究利用同源重組的方法成功構(gòu)建了腸炎沙門菌C50041的lpfC、stdB基因缺失株及回復(fù)株，評價了缺失株和回復(fù)株的生物學(xué)特性，比較其與野生株在感染細(xì)胞能力、同一家族其它基因表達(dá)量及小鼠致病能力等方面的差異，初步探討了腸炎沙門菌在感染宿主過程中l(wèi)pfC

3、和stdB基因發(fā)揮的作用。
　　1腸炎沙門菌C50041△lpfC和C50041△stdB缺失株的構(gòu)建與鑒定
　　本文利用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組技術(shù)構(gòu)建了腸炎沙門菌C50041株的lpfC和stdB基因缺失株C50041△lpfC和C50041△stdB。同時，分別將lpfC和stdB基因克隆至質(zhì)粒pBR322并電轉(zhuǎn)入缺失株中，構(gòu)建了回復(fù)株C50041△lpfCR和C50041△stdBR。比較野生株C50041、缺失株C5

4、0041△lpfC、C50041△stdB及回復(fù)株C50041△lpfCR和C50041△stdBR的基本生物學(xué)特性。生物學(xué)特性分析顯示:lpfC和stdB基因的缺失不影響C50041的生長特性和生化特性，且兩缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。但是缺失株C50041△lpfC對BALB/c小鼠的LD50是野生株的2倍，缺失株C50041△stdB對BALB/c小鼠的LD50是野生株的三分之一。lpfC基因的缺失使腸炎沙門菌對BALB/c小鼠的

5、毒力有所降低，而stdB基因的缺失使腸炎沙門菌對BALB/c小鼠的毒力有所增強，這為進(jìn)一步研究腸炎沙門菌Lpf和Std菌毛的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　2腸炎沙門菌stdB基因功能的初步研究
　　本研究通過體外細(xì)胞感染實驗、細(xì)胞因子和菌毛操縱子其它基因表達(dá)量的檢測及小鼠體內(nèi)細(xì)菌動態(tài)分布實驗等開展對腸炎沙門菌stdB基因的功能初步研究。實驗結(jié)果表明:缺失株對細(xì)菌的運動力沒有影響，但是對l PEC-J2細(xì)胞黏附和侵襲的能力極顯著減弱(

6、p＜0.01)，同時對RAW264.7的侵襲能力有顯著性差異(p＜0.05)。利用RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)試驗結(jié)果和體外感染細(xì)胞RAW264.7試驗結(jié)果中缺失株的stdA、stdC和stdF基因表達(dá)量都降低。用C50041、C50041△stdB和C50041△stdBR分別黏附和侵襲RAW264.7細(xì)胞后，利用RT-PCR方法測定了炎性因子的表達(dá)量變化，在此過程中l(wèi)L-12的表達(dá)量都是極顯著性降低(p＜0.01)。在CBA小鼠動物

7、感染模型試驗結(jié)果中顯示，缺失株和野生株分別感染CBA小鼠后的腸系膜淋巴結(jié)、派爾氏結(jié)、脾臟、肝臟和盲腸從2.5天到25天的變化規(guī)律幾乎是一致的，在5天時比較腸系膜淋巴結(jié)的帶菌量有顯著性差異(p＜0.05);腸炎沙門菌stdB基因缺失后，可以使其在CBA小鼠盲腸內(nèi)的定殖能力下降。本研究為開展腸炎沙門菌stdB基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　3腸炎沙門菌lpfC基因功能的初步研究
　　本研究通過電鏡觀察、體外細(xì)胞感染、細(xì)胞因子和小

8、鼠體內(nèi)細(xì)菌動態(tài)分布等實驗，對腸炎沙門菌定殖、致病、運動等能力進(jìn)行研究。實驗結(jié)果表明:lpfC基因與腸炎沙門菌菌毛的形成有關(guān)，缺失株運動能力和野生株相比有一定程度下降但無顯著性差異，對RAW264.7和HD-11兩種巨噬細(xì)胞侵襲能力變?nèi)?，對lPEC-J2腸上皮細(xì)胞黏附能力減弱。利用RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)試驗結(jié)果和體外感染細(xì)胞RAW264.7試驗結(jié)果中缺失株的lpfA、lpfB和lpfD基因表達(dá)量都降低。用C50041、C50041△

9、lpfC和C50041△lpfCR分別黏附和侵襲RAW264.7細(xì)胞后，利用RT-PCR方法測定了炎性因子的表達(dá)量變化，缺失株黏附和侵襲RAW264.7細(xì)胞時lL-12的表達(dá)量都是極顯著性降低(p＜0.001)，lL-6的表達(dá)量只在黏附時是極顯著性降低(p＜0.001)。在CBA小鼠動物感染模型試驗結(jié)果中顯示，在5天時比較分別感染缺失株和野生株的派爾氏結(jié)帶菌量有顯著性差異(p＜0.01)，缺失株感染后不同監(jiān)測點派爾氏結(jié)的帶菌都不同程度增