EB病毒誘導(dǎo)的基因3功能的初步研究.pdf

1、目的：通過(guò)以下兩方面初步探討EBI3的功能：①構(gòu)建人EBI3的四個(gè)缺失突變體確定EBI3蛋白與Sedlin之間相互作用的區(qū)域；②探討EBI3在小鼠臍帶血管及胎盤(pán)的表達(dá)。 方法：①pACT2-EBI3是我們以Sedlin基因作為誘餌篩選人類(lèi)胎盤(pán)cDNA文庫(kù)獲得的一個(gè)克隆。該質(zhì)粒編碼EBI3蛋白氨基酸54～229，而這部分氨基酸的編碼序列存在NcoI和BamHI各1個(gè)酶切位點(diǎn)。將pACT2-EBI3轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中擴(kuò)增，提取質(zhì)

2、粒并利用上述兩種限制性酶其中之一分別切割，均可得到大小不一的兩個(gè)片段，每個(gè)片段分別回收純化。大片段在T4DNA連接酶作用下自連，分別形成缺失突變體pEBI3m1和pEBI3m2。小片段分別插入pACT2的NcoI和BamHI酶切位點(diǎn)，則得到缺失突變體pEBI3m3和pEBI3m4。4個(gè)缺失突變體分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒并進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定。將以上構(gòu)建的4個(gè)缺失突變體分別與pAS-Sedlin共轉(zhuǎn)化入酵母菌Y190，

3、再進(jìn)行濾膜印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性，即呈藍(lán)色的克隆才是兩種蛋白可能相互作用的陽(yáng)性克隆。②昆明小鼠交配后，以觀察到陰道栓計(jì)為妊娠第0.5d來(lái)確定胚齡，再按照準(zhǔn)確的胚齡分別取12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d、17.5d、18.5d的小鼠胎盤(pán)及臍帶。③使用EBI3多克隆抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)EBI3蛋白的存在，然后通過(guò)HE染色和維多利亞藍(lán)-麗春紅染色(P/VB雙重組合染色)了解臍帶組織結(jié)構(gòu)，以便初步

4、確定陽(yáng)性細(xì)胞類(lèi)型。 結(jié)果：①限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定證明所構(gòu)建質(zhì)粒為以上4個(gè)EBI3突變體重組質(zhì)粒，β-半乳糖苷酶活性測(cè)試表明這4個(gè)克隆均為陽(yáng)性。②12.5～18.5d小鼠胎盤(pán)中均未見(jiàn)EBI3表達(dá)。③結(jié)合臍帶血管組織結(jié)構(gòu)觀察，12.5～18.5d小鼠臍動(dòng)、靜脈平滑肌細(xì)胞呈EBI3免疫陽(yáng)性反應(yīng)。隨著胚齡改變，免疫反應(yīng)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯變化。 結(jié)論：①我們成功地建立利用酵母雙雜交系統(tǒng)2來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。通過(guò)這