不同濃度異煙肼對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的毒性研究.pdf

1、第一部分：新生SD乳鼠原代成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定
　　目的：成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)是成骨細(xì)胞體外實驗的重要來源之一,現(xiàn)主要有酶消化法和組織塊法2種,但這兩種方法各有利弊。本實驗擬探索一種高效、簡便、可靠的體外培養(yǎng)新生SD大鼠原代成骨細(xì)胞的方法。
　　方法：新生清潔級SD乳鼠(出生24h內(nèi))15只,隨機(jī)分為三組,每組5只,經(jīng)乙醇浸泡消毒后取出顱骨,分別采用傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法(A組)、優(yōu)化組織塊法(B組)和酶消化法(C組)進(jìn)行處理,

2、分離和培養(yǎng)成骨細(xì)胞。從細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生長特點、堿性磷酸酶(ALP)染色、ALP活性檢測以及Ι型膠原免疫熒光染色等多方面對培養(yǎng)出的成骨細(xì)胞予以鑒定和比較。
　　結(jié)果：三種方法48h后均培養(yǎng)出成骨細(xì)胞,以骨塊為中心分布,A組數(shù)量最少,C組最多。A、B兩組細(xì)胞從第四天開始增長迅速,第七天達(dá)高峰,C組生長趨勢低于前兩組。ALP染色陽性可見淺棕色至棕黑色色素顆粒,A、B、C組成骨細(xì)胞陽性率依次為85％、92%、81%。ALP活性檢測可見A、

3、B組成骨細(xì)胞活性相似,且明顯高于C組。3組I型膠原免疫熒光染色結(jié)果均呈陽性,A、B組細(xì)胞胞漿中I型膠原表達(dá)明顯多于C組。
　　結(jié)論：優(yōu)化后組織塊法結(jié)合了傳統(tǒng)組織塊法和酶消化法的特點,可短期內(nèi)培養(yǎng)出大量純度高的成骨細(xì)胞,具有成骨細(xì)胞活性及成骨能力,可為骨替代材料或者骨組織工程的研究提供大量細(xì)胞。同時也為初學(xué)者提供了一種切實可行、操作簡單的體外原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法。
　　第二部分：不同濃度異煙肼對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的毒性作用

4、>　　目的：目前我國結(jié)核病疫情十分嚴(yán)重,且合并感染骨結(jié)核者較多,治療復(fù)雜,但效果欠佳。病灶清除術(shù)后聯(lián)合局部抗結(jié)核治療是現(xiàn)行值得考慮的方法之一。異煙肼(INH)作為抗結(jié)核的一線藥物,對細(xì)胞內(nèi)外結(jié)核菌都具有極強(qiáng)的殺菌效果,但對成骨細(xì)胞是否也具有毒性作用尚不明確。本實驗擬研究不同濃度INH對新生SD大鼠原代成骨細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性和Ⅰ型膠原表達(dá)的影響,探討異煙肼對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的毒性作用,為骨結(jié)核病灶清除術(shù)后局部應(yīng)用緩釋微球提

5、供理論依據(jù)。
　　方法：新生清潔級SD乳鼠(出生24h內(nèi))15只,采用優(yōu)化組織塊法體外分離培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞并鑒定,鑒定方法同第一部分。取第3代成骨細(xì)胞,分別采用CCK-8法、堿性磷酸酶活性檢測法和免疫熒光染色法測定,觀察不同濃度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、100μg/ml)異煙肼對成骨細(xì)胞增值、ALP活性以及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：采用優(yōu)化組織

6、塊法成功培養(yǎng)去原代成骨細(xì)胞,24h后逐漸游離出來,在48h細(xì)胞數(shù)增多明顯,排列緊密,三種染色檢測均陽性。給予不同濃度INH干預(yù)72h后,與對照組比較,異煙肼濃度在30μg/ml時,成骨細(xì)胞增長開始受到抑制,ALP活性開始減弱,Ⅰ型膠原合成開始減少。隨著異煙肼濃度增高,這種抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)異煙肼濃度達(dá)60μg/ml時,細(xì)胞活性很弱,大部分細(xì)胞已經(jīng)死亡。
　　結(jié)論：治療骨結(jié)核時,要嚴(yán)格控制異煙肼劑量,INH局部藥物濃度達(dá)到10μg