大豆異黃酮對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．建立和完善OB分離和培養(yǎng)技術(shù) 2．探討sI對(duì)體外培養(yǎng)原代大鼠0B增殖及分化等各方面的影響，為sI預(yù)防治療PMO提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 1．體外大鼠0B的分離、原代培養(yǎng)和鑒定：取新生24小時(shí)Wistar大鼠顱骨，采用交替加入胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶進(jìn)行多次消化法分離0B，進(jìn)行原代體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)第5天、7天、10天進(jìn)行瑞氏染色和ALP染色(偶氮偶聯(lián)法)鑒定0B。 2．SI對(duì)體外原代大鼠0B增

2、殖及分化影響的研究： (1)劑量分組：實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(Normal Control組)，SI各濃度組(10<'-5>M，10<'-6>M，10<'-7>M，10<'-8>M，10<'-9>M)，陽(yáng)性對(duì)照組(E<,2>組，采用10<'-10>M的E<,2>)。 (2)SI對(duì)OB增殖、分化的影響：待細(xì)胞貼壁后換加藥培養(yǎng)基，分別測(cè)定加藥培養(yǎng)基培養(yǎng)1-7天細(xì)胞MTT(0D)，培養(yǎng)2天和4天后，取細(xì)胞培養(yǎng)液測(cè)定0B胞外ALP及

3、BGP含量。 3．SI對(duì)大鼠0B Ⅰ型膠原表達(dá)的影響：待細(xì)胞貼壁后，換加藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)4天后，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增Ⅰ型膠原cDNA，同時(shí)擴(kuò)增管家基因β-actin作為內(nèi)對(duì)照。掃描PCR產(chǎn)物電泳圖片，計(jì)算Ⅰ型膠原/β-actin的相對(duì)豐度比值，推算Ⅰ型膠原基因的相對(duì)表達(dá)水平。 結(jié)果： 1．體外大鼠0B的分離及原代培養(yǎng)和鑒定：所培養(yǎng)的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，三角形等多種形態(tài)，胞漿突起形態(tài)各異，可見(jiàn)成簇生長(zhǎng)，具有典

4、型的OB形態(tài)學(xué)特征；細(xì)胞呈ALP染色陽(yáng)性(陽(yáng)性率>95％)，鑒定為0B。 2．SI對(duì)體外原代大鼠OB增殖和分化影響的結(jié)果： (1)不同濃度SI作用于0B，MTT結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，在培養(yǎng)1～4天，SI10<'-8>M～SI10<'-5>M組的MTT(0D)值有顯著性增高(P<0.05)，從第5天開(kāi)始增殖速度減慢，以第2、3天增殖最為明顯且與E<,2>組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；S110<'-9>M組從第3

5、天開(kāi)始MTT(0D)值低于正常對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常對(duì)照組的增殖曲線可見(jiàn)，1-4天為潛伏期，4-7天處于指數(shù)增殖期，SI各濃度組與E<,2>組進(jìn)入指數(shù)增殖期的時(shí)間早于正常對(duì)照組；E<,2>、SI10<'-8>M、SI10<'-6>M、SI10<'-5>M組其增殖曲線呈現(xiàn)階梯狀。 (2)ALP測(cè)定結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，0B培養(yǎng)第2天時(shí)，E<,2>組和SI10<'-6>M組可顯著提高0B分泌ALP的活性(P<0

6、.05)；0B培養(yǎng)第4天，E<,2>組、SI10<'-6>M組和S110<'-5>M組可顯著提高0B分泌ALP的活性(P<0.05)。與E<,2>組比較，SI10<'-5>M組、SI10<'-9>M組～10<'-7>M組OB分泌ALP的活性低于E<,2>組(P<0.05)。 (3)BGP測(cè)定結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，0B培養(yǎng)第2天時(shí)，E<,2>組和SI10<'-7>M組可顯著提高0B分泌BGP的活性(P<0.05)。OB培養(yǎng)第4天

7、，E<,2>組、SI10<'-8>M組和SI10<'-7>M組可顯著提高0B分泌ALP的活性(P<0.05)。與E<,2>組比較，SI10<'-9>M組、SI10<'-8>M組、SI10<'-6>M組和SI10<'-5>M組OB分泌BGP的活性低于E<,2>組(P<0.05)。 3．SI對(duì)大鼠OB Ⅰ型膠原表達(dá)的影響：與對(duì)照組比較，SI10<'-7>M、SI10<'-5>M組和E<,2>組可顯著增加0B內(nèi)Ⅰ型膠原的合成(P<0.

8、05)。 結(jié)論： 1．以新生24小時(shí)Wistar大鼠顱骨為材料，采用交替加入胰蛋白酶和Ⅱ型膠原進(jìn)行多次消化法分離0B，可獲得高純度、數(shù)量較多、功能活躍的0B。 2．SI對(duì)0B的增殖活性受培養(yǎng)時(shí)間和SI濃度的影響：SI對(duì)0B增殖的有效濃度范圍較大，為10<'-8>M～10<'-5>M，且在作用第2、3天最為顯著；低濃度SI10<'-9>M從第3天開(kāi)始的MTT(0D)值低于正常對(duì)照組。各濃度SI作用0B，其增殖曲線呈

9、現(xiàn)不同形狀且各周期的時(shí)限也不同，可能提示在不同濃度范圍內(nèi)，不同分裂增殖周期中的細(xì)胞對(duì)有效成份的反應(yīng)不同，同時(shí)說(shuō)明SI促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的復(fù)雜性和多樣性。 3．SI10<'-6>M和10<'-5>M有提高0B分泌ALP活性的作用；SI10<'-8>M和10<'-7>M有提高0B外BGP含量的作用。 4．SI10<'-7>M、SI10<'-5>M組可提高Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)。 5．SI與E<,2>對(duì)0B增殖與分化的作用