豬圓環(huán)病毒2型Rep基因致病作用與穿膜肽免疫佐劑作用研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒分PCV1和PCV2兩個(gè)血清型，其中，PCV1對(duì)豬沒有致病性，PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的必須病原。該病毒有兩個(gè)大的開放閱讀框ORF1和ORF2，ORF1主要編碼Rep蛋白，ORF2編碼Cap蛋白，在這兩個(gè)基因之間有1個(gè)復(fù)制原點(diǎn)(Ori)。嵌合病毒PCV1-2（PCV2 ORF2基因嵌合入PCV1）與野生型PCV2相比具有更低的致病力，顯示PCV2 Ori和ORF1可能與PCV2致病作用有關(guān)，但Ori或Re

2、p單個(gè)基因?qū)CV2致病力作用尚無報(bào)道。PCV2在豬群中仍廣泛存在，PCV2疫苗在豬圓環(huán)病毒相關(guān)?。≒CVAD）防控上發(fā)揮著重要作用，但其免疫抗體很難區(qū)分。此外，PCV2 Cap蛋白DNA疫苗雖然也有研究，但仍存在免疫劑量大和抗體產(chǎn)生遲緩等缺點(diǎn)。本研究以PCV2b為骨架，采用PCV1不同基因替代，構(gòu)建并拯救了3個(gè)嵌合病毒，通過仔豬攻毒試驗(yàn)揭示PCV2 Rep基因?yàn)橹饕玖?同時(shí)，采用TAT和Flag作為標(biāo)簽，分別構(gòu)建了3個(gè)標(biāo)記病毒;

3、此外，通過人工合成3種穿膜肽MPG、ppTG20和TAT，分別與PCV2 DNA疫苗混合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)ppTG20對(duì)PCV2 DNA疫苗具有免疫增強(qiáng)作用，為PCV2新型疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。本研究具體內(nèi)容如下:
　　1.豬圓環(huán)病毒2型與1型嵌合病毒的構(gòu)建與致病作用
　　采用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得PCV1和PCV2的全長(zhǎng)基因組，通過基因重組技術(shù)將PCV1和PCV2部分基因替換，構(gòu)建了3個(gè)嵌合病毒全基因組，即PCV2b-Ori1（PC

4、V2b為骨架嵌合PCV1的Ori基因）、PCV2b-rep1（PCV2b為骨架嵌合PCV1的Rep基因）和PCV2b-rep1-Ori1（PCV2b為骨架嵌合PCV1的Ori和Rep基因），同時(shí)，構(gòu)建了PCV1和PCV2重組病毒全基因組作為對(duì)照。各環(huán)化基因組通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞，IFA鑒定結(jié)果顯示均檢測(cè)到具有感染性的病毒粒子存在。連續(xù)5次傳代后，重組病毒PCV2b-Ori1、PCV2b-Rep1和PCV2b-Rep1-Ori1

5、均能穩(wěn)定傳代;PCV2b復(fù)制能力最高，第三代時(shí)病毒即達(dá)106.0TCID50/mL;PCV2-rep1與PCV1-rep1-Ori1復(fù)制能力相似，第3代病毒滴度達(dá)105.0TCID50/mL;PCV2-Oril復(fù)制能力最低，第5代滴度105.0TCID50/mL。病毒一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，PCV2b和PCV1在體外具有相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性，PCV2b-Ori1、PCV2b-rep1和PCV2b-rep1-Ori1嵌合體在36、48、60

6、、72、84和96h滴度明顯低于PCV2b。
　　選擇4周齡PCV2和PRRSV陰性仔豬，用PCV2b、PCV2b-Ori1、PCV2b-rep1、和PCV2b-rep1-Ori1進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組。攻毒后第4、7天臀部和腋下肌肉注射鑰匙孔血藍(lán)蛋白2mg/頭，以及腹腔注射10mL巰基乙酸培養(yǎng)基，另外每頭仔豬在第11、19天腹腔注射10mL巰基乙酸培養(yǎng)基。在攻毒前進(jìn)行稱重，用于計(jì)算每頭豬相對(duì)日增重，攻毒后每天觀察臨

7、床癥狀;攻毒后0、7、11、19和29天采集血清，測(cè)定ELISA抗體，并用Real-time PCR測(cè)定血清病毒含量;攻毒后7、19和29天前腔靜脈采血，分離PBMC，用ConA刺激72h后收集細(xì)胞上清，用定量ELISA檢測(cè)IFN-γ，IL-10，TNF-α和IL-1β細(xì)胞因子;攻毒后第29天計(jì)算相對(duì)日增重，剖殺觀察病理學(xué)變化，并取肺和腹股溝淋巴結(jié)進(jìn)行組織病理變化觀察，同時(shí)，取淋巴結(jié)提取病毒DNA，用Real-time PCR檢測(cè)淋巴結(jié)

8、中的病毒量。結(jié)果為:PCV2b-rep1-Ori1和PCV2b-rep1組臨床癥狀、病毒血癥、淋巴結(jié)病毒量、肺和淋巴結(jié)微觀病理變化、PBMCs分泌IL-10和TNF-α量顯著低于PCV2b感染組。PCV2b-Ori1和PCV2b組在肺和淋巴結(jié)微觀病理變化、淋巴結(jié)病毒量、攻毒后29天病毒血癥、PBMCs分泌TNF-α量上沒有顯著性差異。該研究結(jié)果表明，Rep基因可能在PCV2體內(nèi)致病力上發(fā)揮重要作用。
　　2.豬圓環(huán)病毒2型標(biāo)記重組

9、病毒的構(gòu)建與體外復(fù)制特性
　　采用基因重組技術(shù)將8個(gè)氨基酸Flag標(biāo)簽插入到PCV1-2b(PCV2b-rep1-Ori1)Cap蛋白C端，將11個(gè)氨基酸TAT標(biāo)簽插入到PCV2bCap蛋白C或N端，構(gòu)建出三個(gè)重組基因組，即PCV1-2b-Flag、PCV2b-N-TAT和PCV2b-C-TAT。將環(huán)化基因組轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，IFA檢測(cè)結(jié)果均有感染性的病毒粒子。采用PCV2單克隆抗體Western blot鑒定，PCV2b-N-

10、TAT、PCV2b-C-TAT和PCV1-2b-Flag均能像骨架病毒PCV2b和PCV1-2b一樣與Cap蛋白單克隆抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合;采用Flag單克隆抗體Western blot鑒定，PCV1-2b-Flag感染細(xì)胞有特異條帶出現(xiàn)，大小正確，而PCV1-2b和PK-15細(xì)胞均未出現(xiàn)特異條帶，證明Flag標(biāo)簽在標(biāo)記病毒中得到了表達(dá)。在PK-15連續(xù)5次傳代，PCV2b-N-TAT、PCV2b-C-TAT和PCV1-2b-Flag均能

11、穩(wěn)定傳代，PCV2b-C-TAT復(fù)制能力大于PCV2b-N-TAT，小于PCV2b;PCV1-2b-Flag和PCV1-2b復(fù)制效率相似。PCV2b、PCV2b-N-TAT、PCV2b-C-TAT、PCV1-2b和PCV1-2b-Flag第5代滴度分別為106.16、104.12、105.25、105.16和104.91TCID50/mL。病毒一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，PCV2b-C-TAT、PCV1-2b和PCV1-2b-Flag在體外具

12、有相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性，但PCV2b-N-TAT復(fù)制效率低于此3種病毒。PCV2b-N-TAT、PCV2b-C-TAT、PCV1-2b和PCV1-2b-Flag4種病毒復(fù)制效率均低于PCV2b病毒。標(biāo)記病毒的構(gòu)建為PCV2標(biāo)記疫苗研究提供了重要材料。
　　3.穿膜肽ppTG20增強(qiáng)PCV2DNA疫苗小鼠免疫作用
　　為了提高PCV2DNA疫苗免疫效果，本研究合成MPG、ppTG20和TAT三種穿膜肽，分別和熒光蛋白質(zhì)粒pEG

13、FP-N及PCV2Cap蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-SynCap(m)混合并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果顯示，穿膜肽在低濃度時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N能力較低，隨著MPG、ppTG20和TAT濃度的升高，轉(zhuǎn)染能力有了一定的提高，轉(zhuǎn)染濃度256μg/mL時(shí)ppTG20和TAT轉(zhuǎn)染組較MPG高。MPG、ppTG20和TAT分別與pVAX-SynCap(m)共同轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示其均能將pVAX-SynCap(m)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)

14、胞，其中，ppTG20轉(zhuǎn)染效果最好。將MPG、ppTG20和TAT三種穿膜肽按50μg、100μg和200μg分別與100μgpVAX-SynCap(m)質(zhì)?；旌虾竺庖咝∈?，結(jié)果為:首免后9周，ppTG20200μg免疫組ELISA抗體和中和抗體顯著高于pVAX-SynCap(m)單獨(dú)免疫組。首免后6周和9周，ppTG20200μg免疫組淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答顯著高于pVAX-SynCap(m)單獨(dú)免疫組。首免后9周，50～200μgppTG