腫瘤歸巢穿膜肽介導靶向載藥相變納米粒用于乳腺癌體外超聲分子成像與治療研究.pdf

1、第一部分腫瘤歸巢穿膜肽合成及體外活性研究
　　目的：采用固相法人工合成異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的新型腫瘤歸巢穿膜肽tLyP-1(CGNKRTR)，并于體外檢測其腫瘤靶向性及穿膜特性。
　　方法：采用Na-芴甲氧羰基(Fmoc)法固相合成tLyP-1，并用 FITC標記N端。高效液相色譜及質(zhì)譜儀檢測其純度及分子量；激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀觀察其腫瘤靶向性及穿膜能

2、力；建立三維腫瘤球模型檢測其靶向穿膜性；CCK8（cell counting kit-8)評價其細胞毒性。
　　結(jié)果：合成的FITC-tLyP-1純度為99.14%，分子量為1334.7；激光共聚焦顯微鏡可見FITC-tLyP-1能靶向聚集到MDA-MB-231細胞膜周圍并部分穿膜進入到細胞內(nèi)，而在 HUVEC細胞膜周圍未見明顯的聚集和穿膜現(xiàn)象；流式細胞儀檢測MDA-MB-231細胞內(nèi)熒光強度值高于HUVEC；FITC-tLyP-

3、1可穿入MDA-MB-231三維腫瘤球模型內(nèi)部約120μm；CCK8檢測不同濃度的FITC-tLyP-1對細胞活性沒有明顯影響(P＞0.05)。
　　結(jié)論：采用固相法成功合成 FITC標記的新型腫瘤歸巢穿膜肽tLyP-1，具有乳腺癌MDA-MB-231腫瘤靶向性和穿膜性，能作為一種潛在的腫瘤靶向藥物運輸載體。
　　第二部分腫瘤歸巢穿膜肽介導的靶向載藥相變納米粒制備及體外靶向性、穿膜性研究
　　目的：制備一種新型超聲分子

4、探針--腫瘤歸巢穿膜肽 tLyP-1介導的靶向載10-羥基喜樹堿（10-HCPT）的液-氣相變型氟碳（PFP）納米粒（tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs），檢測其基本表征，并評價其體外靶向性及穿膜性。
　　方法：薄膜水化-聲振法制備新型超聲分子探針，檢測其形態(tài)、分布、粒徑及表面電位；激光共聚焦顯微鏡定性觀察、流式細胞儀定量分析其體外靶向性和細胞穿膜性；建立三維腫瘤球模型檢測納米粒的靶向穿膜性。
　　結(jié)果： tLyP

5、-1-10-HCPT-PFP NPs大小均一、分散性好，粒徑為（366.30±11.50)nm，表面電位為（5.70±3.70）mV；激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs可靶向聚集到MDA-MB-231細胞膜周圍且部分穿膜進入到細胞質(zhì)內(nèi)，而 HUVEC細胞膜周圍未見明顯聚集和穿膜現(xiàn)象；無 tLyP-1肽介導的非靶向載藥相變納米粒（10-HCPT-PFP NPs）在兩種細胞周圍也未見明顯聚集和穿膜現(xiàn)象；流式

6、細胞儀結(jié)果顯示MDA-MB-231細胞內(nèi)tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs的熒光強度明顯高于其余各組（P＜0.05）；MDA-MB-231三維腫瘤球模型的激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示 tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs可穿入MDA-MB-231三維腫瘤球內(nèi)部約80μm，而10-HCPT-PFP NPs在腫瘤球模型表面未見明顯聚集，同時僅見極少量的納米粒進入到腫瘤球內(nèi)部，且距離僅約25μm。
　　結(jié)論：成功制備了腫瘤

7、歸巢穿膜肽 tLyP-1介導的靶向載10-羥基喜樹堿（10-HCPT）的液-氣相變型氟碳（PFP）納米粒（tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs），其能有效地靶向乳腺癌 MDA-MB-231細胞并穿膜進入細胞質(zhì)內(nèi)及腫瘤球內(nèi)部，為后續(xù)實驗奠定了基礎。
　　第三部分腫瘤歸巢穿膜肽介導的靶向載藥相變納米粒體外超聲成像及靶向治療研究
　　目的：制備一種新型超聲分子探針--腫瘤歸巢穿膜肽 tLyP-1介導的靶向載10-羥基喜樹堿

8、（10-HCPT）的液-氣相變型氟碳（PFP）納米粒（tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs），評價其體外超聲成像及對乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外治療效果。
　　方法：高效液相色譜儀檢測所制備納米粒10-HCPT的包封率及載藥率；加熱板加熱和低強度聚焦超聲儀（low intensity focused ultrasound，LIFU）輻照后觀察納米粒液氣相變及體外超聲成像效果；流式細胞儀檢測納米粒對 MDA-MB-2

9、31細胞早晚期凋亡影響，CCK8檢測納米粒對MDA-MB-231細胞毒性作用。
　　結(jié)果：本實驗制備的tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs中10HCPT的包封率為86.04±4.27%，載藥率為7.82±0.38%。tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs加熱到45℃可致相變，此外一定功率的LIFU輻照后也可致相變并能增強超聲成像（P＜0.05）；tLyP-1-10-HCPT-PFP NPs聯(lián)合LIFU輻照后，MDA-