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文檔簡介
1、缺氧/復氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)及氧化應激損傷頻繁發(fā)生于人體各組織,尤其是在呼吸系統(tǒng),因為肺和支氣管直接與外環(huán)境相通并且隨時進行著氣體交換。大量研究證實H/R通常造成活性氧簇(oxygen species,ROS)生成增加,進而始動不可控的氧化應激損傷和隨后的細胞凋亡。這些改變伴隨著細胞器的失活和多種疾病的發(fā)生。另一方面,隨著大氣污染加劇,環(huán)境因素在氣道炎癥性疾病病理機制中的作用日益受到關注。許多肺部炎癥
2、,如慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、肺癌、肺氣腫等很大程度上以反復發(fā)作、病程長為特點。由于通氣受限,這些疾病伴隨乃至加重了長期、反復的缺氧/復氧損傷和氧化應激狀態(tài)。因此,以抗氣道炎癥、抗氧化應激損傷為主的呼吸系統(tǒng)藥物研發(fā)顯得尤為重要。
支氣管上皮細胞是呼吸道抵御外界刺激的第一道防線,大氣污染物、吸煙、機械性損傷等都可造成支氣管上皮細胞損傷。支氣管上皮細胞也是遭受H/R損傷的主要部位。氧化應激損傷持續(xù)存在,導致支氣管、肺組織損傷修復
3、受損,上皮細胞凋亡、脫落,黏液分泌增加,釋放多種炎性因子,加重炎癥反應。
在本論文的第一部分,利用建立的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮(Nitric Oxide,NO)模型,考察TSG在1.25μM至640μM濃度下對LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞生成NO的作用,其IC50=1.20×10-4 M。但對于TNF-α、IL-6和IL-1β的生成影響沒有觀察到顯著性差異。提示TS
4、G具有一定的抗炎活性,但需進一步觀察和系統(tǒng)評價,并且根據(jù)文獻報道,TSG可能具有較好的抗氧化應激損傷活性。故進一步通過建立H/R體外損傷模型,對人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)進行了TSG抗缺氧/復氧損傷活性觀察。結(jié)果顯示,H/R處理后,BEAS-2B細胞增殖受到抑制,而TSG的預處理可以顯著提高H/R損傷后的BEAS-2B細胞的存活率,并且具有較小的細胞毒性。進一步實驗觀察到,在12.5μM的濃度下TSG可顯著抑制細胞活性氧簇(re
5、activeoxygen species,ROS)的生成,同時還可以抑制丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的生成,而超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性沒有顯著性影響。
在本論文的第二部分,對TSG抗氧化應激損傷的機制進行了初步探討。在前部分結(jié)果的基礎上,我們進一步通過實驗表明,TSG能抑制H/R誘導的支氣管上皮細胞BEAS-2B的凋亡。
以GFP-Bax穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人乳
6、腺癌細胞株MCF-7/GFP-Bax為工具,觀察TSG抑制細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax向線粒體轉(zhuǎn)位和抑制核損傷的活性。Hoechst33258染色結(jié)果顯示,TSG(50.0μM、100μM)能明顯抑制H/R誘導的MCF-7/GFP-Bax細胞核固縮和碎片化等損傷。熒光顯微鏡下觀察到,TSG(25.0μM、50.0μM、100μM)抑制Bax向線粒體的轉(zhuǎn)移定位。在BEAS-2B細胞上通過Western Blot法觀察到了同樣TSG抑制Bax向線
7、粒體轉(zhuǎn)位的活性。在H/R誘導的BEAS-2B細胞中,TSG可抑制線粒體膜電位下降、細胞色素C釋放以及caspase-9、caspase-3活化。
絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)在介導炎癥、氧化應激刺激和下游細胞應答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。在H/R發(fā)生之時,氧化應激激活MAPK介導細胞存活或凋亡的級聯(lián)反應。家族內(nèi)的p38 MAPK和SAPK/JNK1/2由炎性細胞因
8、子和環(huán)境應激因素激活,發(fā)揮促凋亡作用,ERK1/2則由生長因子及細胞因子激活,發(fā)揮促進細胞增殖的作用。通過Western Blot觀察了TSG對MAPK信號通路的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,TSG可顯著降低了p38和JNK1/2在H/R處理的BEAS-2B細胞中的磷酸化蛋白質(zhì)/總蛋白比,并存在一定的劑量依賴性。另一方面,還觀察到了TSG還可以通過降低缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor1,HIF-1)的表達,降低核蛋
9、白p53的磷酸化激活,協(xié)同發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用。
概括來說,本論文分兩部分,一部分主要建立了LPS誘導的體外炎癥模型和體外H/R損傷模型、觀察化合物TSG對小鼠腹腔巨噬細胞抗炎和對支氣管上皮細胞抗氧化應激損傷的活性,另一部分主要關注H/R誘導的線粒體凋亡途徑、探討TSG對H/R誘導的支氣管上皮細胞氧化應激損傷保護作用的機制,為防治支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病、肺氣腫等呼吸道疾病新型藥物研發(fā)和缺血-再灌注損傷保護提供了研究思路和
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