靶向Cdc6 RNA干擾抑制舌癌Tca8113細胞增殖的研究.pdf

1、舌鱗狀細胞癌(簡稱舌癌)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，約占43.4％。傳統(tǒng)的手術、放療、化療及其綜合治療對早期舌癌可獲得良好的療效，但對晚期或復發(fā)的患者療效欠佳，其總的五年生存率不足60％。因此，有必要尋找新的診斷及治療方法，以期提高舌癌患者的生存率和生存質量。 Cdc6(細胞分裂周期蛋白6)和Mcms(微小染色體維持蛋白)是目前研究較多的與人的惡性腫瘤關系最密切的兩種DNA復制起始蛋白。Cdc6和Mcms都是真核生物DNA復

2、制調控的重要因子，參與構成DNA復制前復合物。Cdc6的主要功能是在G1期向S期過渡中調節(jié)DNA復制的起始。真核生物細胞的Cdc6是ATP酶家族—AAA+ ATPases成員之一。作為細胞周期中DNA復制的能量代謝酶，具有促進ATP結合與水解的作用。這是人類染色體復制及通過S期所必需的。Cdc6另一功能是參與S—G2/M期檢查點(check—point)的調控，協(xié)調細胞由S期向M期的進程，防止細胞在S期尚未完成DNA復制之前就進入有絲分

3、裂M期。因此Cdc6是DNA復制和細胞增殖所必需的蛋白。Mcms蛋白家族有六個成員(Mcm2-7)，具解鏈酶的活性，同時在DNA復制的起始和延伸兩個階段起作用。 Cdc6和Mcms的表達都是在G1/S轉換時達到高峰，但Cdc6是一個高度不穩(wěn)定的蛋白質，半衰期短，其含量在細胞周期中是波動變化的，而Mcms蛋白卻保持相對恒定。 Cdc6和Mcms主要在增殖活躍的細胞中表達，當細胞進入G0期和分化、衰老時不表達。這一特性在

4、病理學診斷和鑒別診斷中具有重要意義并已應用于臨床。 有研究表明，在宮頸癌、甲狀腺癌、肺癌及腦腫瘤組織中存在高表達的Cdc6和Mcms，而且在某些癌癥(如宮頸癌、膀胱癌)中Cdc6和Mcms標志比傳統(tǒng)的PCNA和Ki—67要靈敏的多。在口腔鱗癌領域，Scott等研究認為Mcms在口腔鱗癌的早期診斷中是一種很有潛力的標志物，Szelachowska等研究提示Mcm2的表達水平可作為口腔鱗癌患者預后判斷的一種方法。另外有研究指出，通過

5、抑制Cdc6和Mcms等多種DNA復制起始蛋白的表達可選擇性阻止腫瘤細胞的增殖，提示選擇性抑制DNA復制起始蛋白的表達，有可能成為一種嶄新而又有效的癌癥治療模式。 RNA干擾技術是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的誘導基因沉默的技術。當外源性或內源性雙鏈RNA(dsRNA)進入細胞后，識別含有其互補序列的mRNA并與之結合，在酶的作用下特異性降解mRNA，從而干擾相應基因表達，導致基因沉默。RNAi效應具有高特異性、高穩(wěn)定性、高效性，已成為

6、腫瘤基因治療研究的重要工具，并已廣泛應用于口腔頜面部腫瘤基因治療的研究。 基因治療的關鍵是基因轉移，即將外源基因(目的基因)特異轉移至靶細胞并使之表達。目前進行基因轉移的方法分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。非病毒載體系統(tǒng)(如顯微注射、電穿孔、基因槍、脂質體介導等)的局限性是轉移的效率太低，而病毒載體系統(tǒng)則克服了這個不足。最常用的病毒載體有慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒載體。其中以HIV-1為基礎構建的慢病毒載體克服了逆

7、轉錄病毒只能感染分裂期細胞的特點，同時又較腺病毒載體的免疫反應小，因而成為目前研究最多、最理想的基因轉移載體之一。 第一部份 Cdc6和Mcm7在舌癌和癌前病變組織及舌癌細胞Tca8113中的表達 方法： 1、采用免疫組化和RT—PCR分別檢測88例石蠟標本(舌癌54例，舌白斑34例)和37例冰凍標本(舌癌22例，舌白斑15例)中Cdc6和Mcm7蛋白與mRNA表達水平，并分析其表達與病理分級，臨床分期及淋巴結轉

8、移等因素之間的相關性。 2、采用Real time RT—PCR和Western Blot檢測人舌癌Tca8113細胞中Cdc6和Mcm7的mRNA和蛋白表達水平。 結果： 1、DNA復制起始蛋白Cdc6、Mcm7在正?？谇徽衬ぶ胁槐磉_或者低表達，在癌前病變和舌癌組織中表達顯著上調且表達量逐漸增強。Cdc6和Mcm7在舌癌Tca8113細胞中高表達。 2、Cdc6和Mcm7在有淋巴結轉移組其陽性標記指數(shù)明

9、顯高于無轉移組。 3、Cdc6和Mcm7的高表達與舌癌發(fā)生及淋巴結轉移有相關性。 第二部分靶向Cdc6 RNA干擾質粒載體的構建與有效靶點的篩選 方法： 1、構建Cdc6 siRNA表達質粒：利用GenBank檢索人Cdc6信息，以EASYTMsiRNA軟件針對Cdc6設計5個靶點。經BLAST驗證，制備雙鏈DNAoligo，連接入雙酶切的RNA干擾載體質粒pGCSIL—GFP，轉化感受態(tài)細胞DH5α，挑

10、取陽性克隆進行PCR鑒定與測序。 2、構建Cdc6真核過表達載體質粒：從cDNA文庫中釣取目的基因Cdc6片段，將目的基因Cdc6片段與真核表達載體pEGFP—N1分別進行酶切并定向克隆連接，轉化感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行PCR鑒定與測序。 3、靶向Cdc6 RNA干擾有效靶點篩選：將前期構建好的目的基因Cdc6過表達載體質粒和針對不同靶點Cdc6 siRNA的表達載體質粒共轉染293T細胞。采用Western blo

11、t檢測Cdc6蛋白表達情況，判斷不同靶點的干擾效果，選出最佳2條序列進入后續(xù)實驗。 結果： 1、針對Cdc6設計的5條siRNA序列均100％命中靶序列，與Cdc6完全同源，特異性高；陰性對照序列不與任何已知基因轉錄子交叉同源。 2、成功構建靶向Cdc6 RNAi載體質粒：pGCSIL—GFP—Cdc6 shRNA。 3、成功構建Cdc6過表達載體質粒：pEGFP—N1-Cdc6。 4、經外源篩靶

12、實驗顯示各實驗組較NC組對Cdc6基因表達均能起到不同程度的敲減作用，其中Target3和Target4靶點對目的基因的表達有顯著的敲減作用，因而選擇Target3:5’—GAGATCAGGTTCTGGACAA—3’和Target4：5’—GGAGAGCTATTGAAATTGT—3’，分別記為KD1和KD2，作為下一階段實驗的RNAi有效靶點序列。 第三部分靶向Cdc6 RNAi慢病毒載體的構建及其抑制舌癌細胞增殖的研究

13、 方法： 1、慢病毒載體的制備、滴度測定和Tca8113細胞轉染效率的測定 2、靶向Cdc6慢病毒載體RNAi系統(tǒng)敲減效能的檢測： ①Real time RT—PCR和Western Blot檢測RNA干擾對Tca8113細胞Cdc6 mRNA和蛋白表達水平的敲減效能。 ②流式細胞儀檢測細胞周期改變 ③MTT法檢測Tca8113細胞生長水平 ④細胞小室侵襲實驗檢測Tca8113細胞侵襲率

14、 結果： 1、成功制備2條靶向Cdc6 RNAi慢病毒載體KD1和KD2，病毒滴度分別為1.8x109TU/ml和8.0x108TU/ml。該慢病毒載體可有效感染舌癌Tca8113細胞株，最佳感染條件為MOI=20。 2、Real time RT—PCR結果顯示：KD1和KD2靶點對Tca8113細胞Cdc6 mRNA的表達均有顯著敲減效果(p<0.05)。相對NC組，KD1、KD2組對Cdc6基因敲減效率分別為5

15、0％和65％。 3、Western Blot結果顯示：感染靶向Cdc6 RNAi慢病毒載體后，Tca8113細胞Cdc6蛋白表達水平明顯下降，KD1、KD2組較NC組Cdc6蛋白表達降低分別為65.87％、79.38％。 4、流式細胞儀檢測細胞周期顯示：感染慢病毒載體后，KD組S期細胞比率明顯下調，KD1組較NC組下調41.53％，KD2組下調43.52％，KD組G1期細胞比率上調，但沒有出現(xiàn)明顯的凋亡峰。 5、

16、MTT法檢測細胞生長水平：KD組細胞生長水平受到抑制，KD1細胞生長抑制率為25.84％，KD2細胞生長抑制率為30.34％。 6、細胞小室侵襲實驗結果顯示：靶向Cdc6 RNAi慢病毒載體感染Tca8113后，細胞侵襲率未見明顯改變。 結論： 1、DNA復制起始蛋白Cdc6和Mcm7在舌癌和癌前病變組織中呈高表達，其高表達與舌癌的發(fā)生及轉移有相關性，推測其可能在舌癌發(fā)生與淋巴結轉移中起重要作用。檢測舌癌組織中C