靶向Cdc6 RNA干擾抑制舌癌Tca8113細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、舌鱗狀細(xì)胞癌(簡稱舌癌)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，約占43.4％。傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療及其綜合治療對早期舌癌可獲得良好的療效，但對晚期或復(fù)發(fā)的患者療效欠佳，其總的五年生存率不足60％。因此，有必要尋找新的診斷及治療方法，以期提高舌癌患者的生存率和生存質(zhì)量。 Cdc6(細(xì)胞分裂周期蛋白6)和Mcms(微小染色體維持蛋白)是目前研究較多的與人的惡性腫瘤關(guān)系最密切的兩種DNA復(fù)制起始蛋白。Cdc6和Mcms都是真核生物DNA復(fù)

2、制調(diào)控的重要因子，參與構(gòu)成DNA復(fù)制前復(fù)合物。Cdc6的主要功能是在G1期向S期過渡中調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的起始。真核生物細(xì)胞的Cdc6是ATP酶家族—AAA+ ATPases成員之一。作為細(xì)胞周期中DNA復(fù)制的能量代謝酶，具有促進(jìn)ATP結(jié)合與水解的作用。這是人類染色體復(fù)制及通過S期所必需的。Cdc6另一功能是參與S—G2/M期檢查點(diǎn)(check—point)的調(diào)控，協(xié)調(diào)細(xì)胞由S期向M期的進(jìn)程，防止細(xì)胞在S期尚未完成DNA復(fù)制之前就進(jìn)入有絲分

3、裂M期。因此Cdc6是DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖所必需的蛋白。Mcms蛋白家族有六個(gè)成員(Mcm2-7)，具解鏈酶的活性，同時(shí)在DNA復(fù)制的起始和延伸兩個(gè)階段起作用。 Cdc6和Mcms的表達(dá)都是在G1/S轉(zhuǎn)換時(shí)達(dá)到高峰，但Cdc6是一個(gè)高度不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，半衰期短，其含量在細(xì)胞周期中是波動(dòng)變化的，而Mcms蛋白卻保持相對恒定。 Cdc6和Mcms主要在增殖活躍的細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G0期和分化、衰老時(shí)不表達(dá)。這一特性在

4、病理學(xué)診斷和鑒別診斷中具有重要意義并已應(yīng)用于臨床。 有研究表明，在宮頸癌、甲狀腺癌、肺癌及腦腫瘤組織中存在高表達(dá)的Cdc6和Mcms，而且在某些癌癥(如宮頸癌、膀胱癌)中Cdc6和Mcms標(biāo)志比傳統(tǒng)的PCNA和Ki—67要靈敏的多。在口腔鱗癌領(lǐng)域，Scott等研究認(rèn)為Mcms在口腔鱗癌的早期診斷中是一種很有潛力的標(biāo)志物，Szelachowska等研究提示Mcm2的表達(dá)水平可作為口腔鱗癌患者預(yù)后判斷的一種方法。另外有研究指出，通過

5、抑制Cdc6和Mcms等多種DNA復(fù)制起始蛋白的表達(dá)可選擇性阻止腫瘤細(xì)胞的增殖，提示選擇性抑制DNA復(fù)制起始蛋白的表達(dá)，有可能成為一種嶄新而又有效的癌癥治療模式。 RNA干擾技術(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的誘導(dǎo)基因沉默的技術(shù)。當(dāng)外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入細(xì)胞后，識別含有其互補(bǔ)序列的mRNA并與之結(jié)合，在酶的作用下特異性降解mRNA，從而干擾相應(yīng)基因表達(dá)，導(dǎo)致基因沉默。RNAi效應(yīng)具有高特異性、高穩(wěn)定性、高效性，已成為

6、腫瘤基因治療研究的重要工具，并已廣泛應(yīng)用于口腔頜面部腫瘤基因治療的研究。 基因治療的關(guān)鍵是基因轉(zhuǎn)移，即將外源基因(目的基因)特異轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞并使之表達(dá)。目前進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的方法分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。非病毒載體系統(tǒng)(如顯微注射、電穿孔、基因槍、脂質(zhì)體介導(dǎo)等)的局限性是轉(zhuǎn)移的效率太低，而病毒載體系統(tǒng)則克服了這個(gè)不足。最常用的病毒載體有慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒載體。其中以HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體克服了逆

7、轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂期細(xì)胞的特點(diǎn)，同時(shí)又較腺病毒載體的免疫反應(yīng)小，因而成為目前研究最多、最理想的基因轉(zhuǎn)移載體之一。 第一部份 Cdc6和Mcm7在舌癌和癌前病變組織及舌癌細(xì)胞Tca8113中的表達(dá) 方法： 1、采用免疫組化和RT—PCR分別檢測88例石蠟標(biāo)本(舌癌54例，舌白斑34例)和37例冰凍標(biāo)本(舌癌22例，舌白斑15例)中Cdc6和Mcm7蛋白與mRNA表達(dá)水平，并分析其表達(dá)與病理分級，臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

8、移等因素之間的相關(guān)性。 2、采用Real time RT—PCR和Western Blot檢測人舌癌Tca8113細(xì)胞中Cdc6和Mcm7的mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1、DNA復(fù)制起始蛋白Cdc6、Mcm7在正?？谇徽衬ぶ胁槐磉_(dá)或者低表達(dá)，在癌前病變和舌癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)且表達(dá)量逐漸增強(qiáng)。Cdc6和Mcm7在舌癌Tca8113細(xì)胞中高表達(dá)。 2、Cdc6和Mcm7在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組其陽性標(biāo)記指數(shù)明

9、顯高于無轉(zhuǎn)移組。 3、Cdc6和Mcm7的高表達(dá)與舌癌發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。 第二部分靶向Cdc6 RNA干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建與有效靶點(diǎn)的篩選 方法： 1、構(gòu)建Cdc6 siRNA表達(dá)質(zhì)粒：利用GenBank檢索人Cdc6信息，以EASYTMsiRNA軟件針對Cdc6設(shè)計(jì)5個(gè)靶點(diǎn)。經(jīng)BLAST驗(yàn)證，制備雙鏈DNAoligo，連接入雙酶切的RNA干擾載體質(zhì)粒pGCSIL—GFP，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑

10、取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定與測序。 2、構(gòu)建Cdc6真核過表達(dá)載體質(zhì)粒：從cDNA文庫中釣取目的基因Cdc6片段，將目的基因Cdc6片段與真核表達(dá)載體pEGFP—N1分別進(jìn)行酶切并定向克隆連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定與測序。 3、靶向Cdc6 RNA干擾有效靶點(diǎn)篩選：將前期構(gòu)建好的目的基因Cdc6過表達(dá)載體質(zhì)粒和針對不同靶點(diǎn)Cdc6 siRNA的表達(dá)載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。采用Western blo

11、t檢測Cdc6蛋白表達(dá)情況，判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果，選出最佳2條序列進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果： 1、針對Cdc6設(shè)計(jì)的5條siRNA序列均100％命中靶序列，與Cdc6完全同源，特異性高；陰性對照序列不與任何已知基因轉(zhuǎn)錄子交叉同源。 2、成功構(gòu)建靶向Cdc6 RNAi載體質(zhì)粒：pGCSIL—GFP—Cdc6 shRNA。 3、成功構(gòu)建Cdc6過表達(dá)載體質(zhì)粒：pEGFP—N1-Cdc6。 4、經(jīng)外源篩靶

12、實(shí)驗(yàn)顯示各實(shí)驗(yàn)組較NC組對Cdc6基因表達(dá)均能起到不同程度的敲減作用，其中Target3和Target4靶點(diǎn)對目的基因的表達(dá)有顯著的敲減作用，因而選擇Target3:5’—GAGATCAGGTTCTGGACAA—3’和Target4：5’—GGAGAGCTATTGAAATTGT—3’，分別記為KD1和KD2，作為下一階段實(shí)驗(yàn)的RNAi有效靶點(diǎn)序列。 第三部分靶向Cdc6 RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其抑制舌癌細(xì)胞增殖的研究

13、 方法： 1、慢病毒載體的制備、滴度測定和Tca8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的測定 2、靶向Cdc6慢病毒載體RNAi系統(tǒng)敲減效能的檢測： ①Real time RT—PCR和Western Blot檢測RNA干擾對Tca8113細(xì)胞Cdc6 mRNA和蛋白表達(dá)水平的敲減效能。 ②流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期改變 ③MTT法檢測Tca8113細(xì)胞生長水平 ④細(xì)胞小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Tca8113細(xì)胞侵襲率

14、 結(jié)果： 1、成功制備2條靶向Cdc6 RNAi慢病毒載體KD1和KD2，病毒滴度分別為1.8x109TU/ml和8.0x108TU/ml。該慢病毒載體可有效感染舌癌Tca8113細(xì)胞株，最佳感染條件為MOI=20。 2、Real time RT—PCR結(jié)果顯示：KD1和KD2靶點(diǎn)對Tca8113細(xì)胞Cdc6 mRNA的表達(dá)均有顯著敲減效果(p<0.05)。相對NC組，KD1、KD2組對Cdc6基因敲減效率分別為5

15、0％和65％。 3、Western Blot結(jié)果顯示：感染靶向Cdc6 RNAi慢病毒載體后，Tca8113細(xì)胞Cdc6蛋白表達(dá)水平明顯下降，KD1、KD2組較NC組Cdc6蛋白表達(dá)降低分別為65.87％、79.38％。 4、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期顯示：感染慢病毒載體后，KD組S期細(xì)胞比率明顯下調(diào)，KD1組較NC組下調(diào)41.53％，KD2組下調(diào)43.52％，KD組G1期細(xì)胞比率上調(diào)，但沒有出現(xiàn)明顯的凋亡峰。 5、

16、MTT法檢測細(xì)胞生長水平：KD組細(xì)胞生長水平受到抑制，KD1細(xì)胞生長抑制率為25.84％，KD2細(xì)胞生長抑制率為30.34％。 6、細(xì)胞小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：靶向Cdc6 RNAi慢病毒載體感染Tca8113后，細(xì)胞侵襲率未見明顯改變。 結(jié)論： 1、DNA復(fù)制起始蛋白Cdc6和Mcm7在舌癌和癌前病變組織中呈高表達(dá)，其高表達(dá)與舌癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，推測其可能在舌癌發(fā)生與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用。檢測舌癌組織中C