發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)IRT1基因轉(zhuǎn)化鎘超富集植物油菜的研究.pdf

1、目的:重金屬鎘(Cd)因其致癌性強(qiáng)而引起業(yè)界廣泛關(guān)注，Cd可通過(guò)工業(yè)廢水、廢渣污染土壤和水源，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入到動(dòng)物及人體內(nèi)對(duì)生物造成不可逆的損害。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用植物進(jìn)行Cd污染的修復(fù)顯示出良好的應(yīng)用潛力。
　　自然界中存在可以富集Cd的超富集植物，能夠在一定濃度的Cd污染環(huán)境中生存，并通過(guò)新陳代謝機(jī)制攝取和固定Cd。但目前已知的Cd超富集植物存在富集系數(shù)低、富集量有限等缺點(diǎn)，影響了實(shí)際應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，

2、利用基因工程的手段對(duì)Cd超富集植物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造，是促進(jìn)Cd污染環(huán)境植物修復(fù)技術(shù)發(fā)展的重要途徑。
　　因此本論文選擇分布廣泛、易獲得的Cd超富集植物油菜(Brassica campestrisL.)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造研究，希望通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法建立轉(zhuǎn)基因的油菜毛狀根體系，今后可利用轉(zhuǎn)基因毛狀根體系作為Cd富集轉(zhuǎn)基因改造研究平臺(tái)。
　　方法:利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)油菜進(jìn)行轉(zhuǎn)基因毛狀根的誘導(dǎo)和基因改造研究。利用油菜種子進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)

3、獲得外植體，同時(shí)將發(fā)根土壤桿菌ATCC15834進(jìn)行單克隆培養(yǎng)、活化，將活化好的菌液與外植體子葉外植體進(jìn)行共培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)移至含頭孢噻肟鈉(Cephalosporins，Cef)的培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌，10d后可獲得油菜毛狀根。設(shè)計(jì)引物對(duì)油菜毛狀根進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢驗(yàn)rolB基因是否已整合進(jìn)入植物毛狀根組織。同時(shí)對(duì)不同的侵染時(shí)間、不同濃度萘乙酸(NAA)對(duì)油菜毛狀根誘導(dǎo)的影響進(jìn)行分析研究。
　　在確定油菜毛狀根成功獲得的基礎(chǔ)上，利用Tak

4、ara公司的pRI101質(zhì)粒將與Cd富集相關(guān)的IRT1基因整合進(jìn)ATCC15834菌種中，并利用改造過(guò)的ATCC15834浸染油菜子葉外植體，誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)IRT1基因毛狀根。同樣設(shè)計(jì)引物利用PCR技術(shù)進(jìn)行IRT1基因、rol B基因的檢驗(yàn)，確定IRT1基因、rolB基因已經(jīng)整合植物毛狀根組織的DNA中。
　　最后對(duì)轉(zhuǎn)IRT1基因毛狀根進(jìn)行Cd富集實(shí)驗(yàn)研究。將轉(zhuǎn)IRT1基因油菜毛狀根與野生菌誘導(dǎo)的油菜毛狀根分別置于含不同濃度Cd的培養(yǎng)

5、基上進(jìn)行暗培養(yǎng)。7d和14d分別取樣進(jìn)行生物量、毛狀根富集的Cd含量、培養(yǎng)基殘留Cd含量的測(cè)定，探討轉(zhuǎn)入IRT1基因提高油菜毛狀根富集Cd的可能性。
　　結(jié)果:設(shè)計(jì)引物對(duì)油菜毛狀根進(jìn)行PCR檢測(cè)，可以檢測(cè)到大小為423bp的rolB基因條帶，確定發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中的rolB基因已整合進(jìn)入植物毛狀根組織DNA中。目前未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道油菜毛狀根的成功誘導(dǎo)。不同的侵染時(shí)間對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)有著較明顯的影響，在一定范圍的侵染時(shí)間內(nèi)，毛狀根的誘

6、導(dǎo)率呈正態(tài)分布，其中侵染時(shí)間為4h時(shí)，毛狀根的誘導(dǎo)率最高;在培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA也能不同程度地促進(jìn)油菜毛狀根的生長(zhǎng)，在0～1.0mg/L的范圍內(nèi)，NAA濃度越高，油菜毛狀根誘導(dǎo)率越高。
　　重組質(zhì)粒IRT1-pRI101經(jīng)測(cè)序后證明構(gòu)建成功。經(jīng)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒IRT1-pRI101獲得的重組菌ATCC15834侵染油菜子葉外植體獲得轉(zhuǎn)IRT1毛狀根，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行IRT1基因、rolB基因的PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明毛狀根DNA中

7、存在423bp、471bp大小條帶，證明rolB基因、IRT1基因已經(jīng)整合進(jìn)入植物毛狀根組織。
　　Cd富集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生型和轉(zhuǎn)IRT1油菜毛狀根都能有效地富集培養(yǎng)基中的Cd。在不同濃度的Cd環(huán)境下，轉(zhuǎn)入了IRT1基因的毛狀根比野生型毛狀根的生長(zhǎng)狀況更好，對(duì)Cd的富集量更高。隨著培養(yǎng)基中Cd濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)IRT1油菜毛狀根對(duì)Cd的富集量也隨之增加。在100μmol/LCd培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后，轉(zhuǎn)IRT1基因毛狀