用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法探究木豆耐鋁基因的特性.pdf

1、在亞洲國(guó)家中酸性土壤中，豆類作物的栽培非常普遍，豆類作物是這些國(guó)家人口糧食的主要蛋白源，而在酸性土壤中，過(guò)量的質(zhì)子和過(guò)量的鋁造成的根際鋁毒是豆類作物低產(chǎn)的主要原因，也是酸性土壤最常見(jiàn)的問(wèn)題。為了探究豆類作物中的耐鋁基因的功能，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，提高豆類作物的耐鋁特性，本研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)高效的發(fā)根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，這個(gè)方法可用于表征基因功能，調(diào)節(jié)脈沖作物的耐鋁性。
　　1.建立高效的土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生根狀毛系統(tǒng)。利用發(fā)根土壤農(nóng)桿菌侵染煙

2、草葉片，將土壤農(nóng)桿菌中的重要遺傳信息轉(zhuǎn)導(dǎo)到煙草的根狀毛中，其高效轉(zhuǎn)導(dǎo)的成功率是整個(gè)研究的關(guān)鍵。通過(guò)插入攜帶待研究的目的基因克隆到T-DNA上，通過(guò)電穿孔技術(shù)將攜帶目的基因的T-DNA插入土壤農(nóng)桿菌中，隨后通過(guò)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，土壤農(nóng)桿菌中的Ri質(zhì)粒會(huì)與攜帶目的基因的T-DNA共同進(jìn)入煙草葉片產(chǎn)生的根狀毛中。本研究的結(jié)果表明，利用土壤農(nóng)桿菌攜帶三種不同的目的基因介導(dǎo)野生型煙草和NtSTOP1突變體煙草葉片得到根毛的概率在80％以上，目的基因插入根

3、毛的概率在90％以上。
　　2.得到高效的根毛轉(zhuǎn)化系統(tǒng)后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證使用土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草根狀毛與煙草植株的根系是否在生理功能上一致，通過(guò)使用兩種不同形狀的煙草作為介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的宿主進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定通過(guò)土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的煙草的根毛的耐鋁基因的遺傳信息和有機(jī)酸分泌的情況，研究結(jié)果表明，通過(guò)土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)野生型煙草和NtSTOP1突變體煙草葉片形成的根狀毛的有機(jī)酸分泌水平和NtSTOP1，NtMATE, NtALS3的表達(dá)量信息與前

4、人使用這兩種性狀的煙草植株實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致，即NtSTOP1突變體煙草根毛沒(méi)有分泌有機(jī)酸的功能，在無(wú)論是否有鋁脅迫的情況下，NtSTOP1和關(guān)聯(lián)基因NtMATE和NtALS3的表達(dá)量水平都很低。
　　3.高效穩(wěn)定的煙草根狀毛系統(tǒng)的應(yīng)用。在木豆(Cajanus cajan(L.)中克隆得到MATE（多藥有毒化合物排出）基因并用綠色熒光蛋白進(jìn)行細(xì)胞融合，標(biāo)記CcMATE1∷ sGFP,在載體pBEAB中表達(dá)后通過(guò)電穿孔技術(shù)將其插入土

5、壤農(nóng)桿菌中的迷你Ti質(zhì)粒中，隨后通過(guò)土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)NtSTOP1突變體煙草葉片得到根狀毛，通過(guò)進(jìn)行觀察綠色熒光蛋白的煙草根狀毛來(lái)篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的煙草根狀毛來(lái)進(jìn)行后續(xù)的研究。通過(guò)綠色熒光顯微鏡觀察得到CcMATE1在根尖細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)。原本沒(méi)有耐鋁功能的NtSTOP1突變體煙草根狀毛，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后攜帶CcMATE1基因的NtSTOP1突變體煙草根狀毛根尖有機(jī)酸分泌量是對(duì)照實(shí)驗(yàn)有機(jī)酸分泌量的4倍。
　　綜上所述，通過(guò)土壤