氯苯乙烯三甲基吡嗪對氧化損傷血管內(nèi)皮細胞的保護作用研究.pdf

1、心腦血管疾病是致死率和致殘率最高的臨床常見病和多發(fā)病，是世界衛(wèi)生組織（WHO）認定的危害人類健康的“頭號殺手”。血管內(nèi)皮細胞功能障礙是多種心腦血管疾病發(fā)病的共同環(huán)節(jié)，它觸發(fā)和促進動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗塞等。多種因素，如急性缺血、中毒、氧化應(yīng)激、同型半胱氨酸血癥等都可引起血管內(nèi)皮細胞腫脹、脫落、凋亡、壞死等損傷。川芎嗪是中藥川芎的主要有效成分之一，具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴張血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用，廣泛應(yīng)用于臨床治

2、療。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化，生成極性和水溶性較大的代謝物而被迅速排出體外，所以川芎嗪存在半衰期短，生物利用度低等缺點。經(jīng)川芎嗪及其衍生物構(gòu)效關(guān)系研究，證實吡嗪環(huán)為其基本藥效基團；2，3，5，6位甲基為藥代基團。芪類衍生物具有抗血小板聚集、降血壓等廣泛的心腦血管活性，其代表化合物白黎蘆醇的心腦血管活性得到了大家的一致認可。因此，以白黎蘆醇為結(jié)構(gòu)模型，在保持其基本骨架不變的前提下，以吡嗪環(huán)替代其中一個苯環(huán)，即在川芎嗪側(cè)鏈上引入取代苯乙

3、烯基，設(shè)計合成了一系列川芎嗪芪類衍生物，其中根據(jù)生物電子等排體原理，將OH以電子等排體Cl—替代，設(shè)計合成了氯取代衍生物反式—2—（2—氯苯乙烯）—3，5，6—三甲基吡嗪。以白藜蘆醇的活性基團取代川芎嗪分子的藥代基團，以期克服川芎嗪體內(nèi)半衰期短、生物利用度低等缺點，并通過協(xié)同作用增強藥效，提高抗心腦血管疾病作用。本研究采用過氧化氫作為外源性自由基生成系統(tǒng)，模擬血管內(nèi)皮細胞的脂質(zhì)過氧化損傷，建立離體培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷模型，觀察

4、2—（2—氯苯乙烯）—3，5，6—三甲基吡嗪對氧化損傷的血管內(nèi)皮細胞的保護作用及其可能的機制，為其用于心、腦血管疾病治療提供進一步的資料，同時也為傳統(tǒng)中藥的開發(fā)提供新思路。主要研究內(nèi)容如下： ⑴采用MTT法測定細胞存活力。實驗結(jié)果顯示，HUVECs細胞氧化損傷后，細胞活力顯著降低（P<0．001）。經(jīng)氯苯乙烯三甲基吡嗪25、50、100μmol/L處理后細胞活力明顯增強（P<0．001）。 ⑵收集氧化損傷處理后的HUVE

5、Cs細胞培養(yǎng)上清液和細胞裂解液，參照試劑盒說明分別測定培養(yǎng)上清液和細胞裂解液中的LDH活性，計算細胞LDH釋放率。實驗結(jié)果表明，HVECs細胞經(jīng)H2O2損傷后，細胞膜通透性增加，胞內(nèi)LDH漏出增多，培養(yǎng)液中LDH活力顯著增加（P<0．01）。經(jīng)氯苯乙烯三甲基吡嗪25、50、100μmol/L，處理后，明顯抑制細胞內(nèi)LDH的釋放（P<0．01）。 ⑶收集氧化損傷處理后的HUVECs細胞內(nèi)蛋白。參照MDA、 SOD、GSH檢測試劑盒

6、說明分別測定細胞MDA、GSH含量、SOD活力。實驗結(jié)果表明，細胞氧化損傷后MDA與GSH含量顯著增加（P<0．01），SOD活力顯著降低（P<0．001）。經(jīng)氯苯乙烯三甲基吡嗪25、50、100μmol/L處理后，細胞MDA含量顯著減少（P<0．01）；GSH含量和SOD活力顯著增高（P<0．01）。 ⑷收集氧化損傷處理后的HUVECs細胞內(nèi)蛋白。參照NO和NOS檢測試劑盒說明分別測定細胞NO含量、NOS活力。實驗結(jié)果表明，氧

7、化損傷后胞內(nèi)NO含量顯著增加（P<0．01），NOS活力顯著降低（P<0．01）。經(jīng)氯苯乙烯三甲基吡嗪25、50、100μmol/L，處理后，細胞NO含量顯著減少（P<0．01）；NOS活力顯著升高（P<0．01）。 ⑸細胞經(jīng)處理后，以多聚甲醛室溫固定，Hoechst33258染色并于熒光顯微鏡下觀察并拍照。實驗結(jié)果表明，細胞經(jīng)Hoechst33258染色后，正常組細胞核較大且染色均勻；模型組細胞核內(nèi)可見致密的顆粒狀熒光，呈現(xiàn)出

8、凋亡細胞典型的核固縮、核碎裂表現(xiàn)；氯苯乙烯三甲基吡嗪各濃度組細胞的胞核形態(tài)趨于正常，凋亡細胞數(shù)明顯減少。 ⑹細胞經(jīng)處理后，以Annexin V—FITC/PI雙染后上流式細胞儀檢測。實驗結(jié)果表明，與正常組比較，模型組細胞的凋亡率明顯升高（P<0．01）。與模型組比較，氯苯乙烯三甲基吡嗪各濃度組細胞的凋亡率降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0．01）。 ⑺細胞經(jīng)處理后，按Western blotting方法檢測ERK1/2蛋

9、白，P—ERK1/2蛋白表達。實驗結(jié)果表明，與正常組相比，模型組細胞ERK1/2蛋白表達無明顯變化，由于H2O2的刺激使細胞本身產(chǎn)生保護細胞促其生存的應(yīng)激反應(yīng)，作為促進細胞生存途徑中的重要蛋白P—ERK1/2表達明顯增高（P<0．01）。經(jīng)氯苯乙烯三甲基吡嗪100μmol/L處理后，細胞的ERK1/2蛋白表達仍無明顯變化，與過氧化氫損傷組相比，p—ERK1/2表達明顯增加（P<0．05），這是由于本藥物可能通過上調(diào)促細胞生存蛋白p—ER