川芎嗪二苯甲基哌嗪對氧化損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用過氧化氫作為外源性自由基生成系統(tǒng)，模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞的脂過氧化損傷，建立離體培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)氧化應(yīng)激損傷模型，觀察川芎嗪二苯甲基哌嗪對氧化損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，其用于心、腦血管疾病治療提供進(jìn)一步的資料，同時也為傳統(tǒng)中藥的開發(fā)提供新思路。 1. 川芎嗪二苯甲基哌嗪對H2O2氧化損傷ECV-304細(xì)胞活性的影響 采用MTT法測定細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ECV-304細(xì)胞氧化損

2、傷后，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)。經(jīng)川芎嗪二苯甲基哌嗪10、50、100μmol/L處理后細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(P<0.01)。 2．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)液LDH釋放率的影響收集氧化損傷處理后的：ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液，參照試劑盒說明分別測定培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中的LDH活性，計(jì)算細(xì)胞LDH釋放率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ECV-304細(xì)胞經(jīng)H<,2>O<,2>損傷后

3、，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞膜通透性增加，胞內(nèi)LDH漏出增多，培養(yǎng)液中LDH活力顯著增加(P<0.01)。經(jīng)川芎嗪二苯甲基哌嗪50、100 μmol/L處理后，細(xì)胞LDH釋放顯著減少(P<0.01)。 3．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力的影響收集氧化損傷處理后的ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)上清液。參照MDA、SOD、GSH-Px檢測試劑盒說明分別測定細(xì)胞MDA

4、含量、SOD活力、GSH-Px活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧化損傷后胞內(nèi)MDA含量顯著增加(P<0.01)，SOD活力與GSH-Px活力顯著降低(P<0.01)。經(jīng)川芎嗪二苯甲基哌嗪10、50、100μmol/L處理后，細(xì)胞MDA含量顯著減少(P<0.01)；SOD活力和GSH-Px活力均顯著升高(P<0.01)。 4．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H202氧化損傷ECV-304細(xì)胞ROS的影響細(xì)胞經(jīng)處理后制備細(xì)胞懸液，以：DCFH-DA負(fù)載細(xì)胞

5、。將細(xì)胞懸液分成六組：正常組、模型組及各濃度藥物作用組，依次加到96孔板中，置多功能酶標(biāo)儀檢測熒光值(λ<,ex>=488nm，λ<,em>=525nm)。按公式計(jì)算ROS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H<,2>O<,2>氧化損傷后胞內(nèi)：ROS濃度顯著升高(P<0.01)，而川芎嗪二苯甲基哌嗪10、50、100μmol/L能明顯降低氧化受損細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度(P<0.05)。 5．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304

6、細(xì)胞染色質(zhì)的影響細(xì)胞經(jīng)處理后，以多聚甲醛室溫固定，Hoechst 33258染色并于熒光顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色后，正常組細(xì)胞核較大且染色均勻；模型組細(xì)胞核內(nèi)可見致密的顆粒狀熒光，呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞典型的核固縮、核碎裂表現(xiàn)；川芎嗪二苯甲基哌嗪各濃度組細(xì)胞的胞核形態(tài)趨于正常，且凋亡細(xì)胞數(shù)隨劑量增加而減少。 6．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細(xì)胞凋亡率的影響細(xì)

7、胞經(jīng)處理后，以Annexin V-FITC/PI雙染后上流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，川芎嗪二苯甲基哌嗪各濃度組細(xì)胞的凋亡率降低，且呈劑量依賴性關(guān)系，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 7.川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度的影響制備細(xì)胞懸液，以Fura-2/AM負(fù)載。將細(xì)胞懸液分成六組：正常組、模型組及各濃

8、度藥物作用組依次加到96孔板中，置多功能酶標(biāo)儀檢測λ<,ex>=340 nm/λ<,em>=510 nm和λ<,ex>=380 nm/λ<,em>=510 nm處熒光比值。按公式計(jì)算[Ca<'2+>]<,i>。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ECV-304細(xì)胞氧化損傷后胞內(nèi)游離鈣離子濃度顯著升高(P<0.01)，而川芎嗪二苯甲基哌嗪50、100 μmol/L能顯著抑制胞內(nèi)鈣濃度(P<0.01)。 8.川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損

9、傷ECV-304細(xì)胞線粒體膜電位的影響細(xì)胞經(jīng)處理后，經(jīng)Rh123染色后上流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，川芎嗪二苯甲基哌嗪組細(xì)胞線粒體膜電位顯著升高，且呈劑量依賴性關(guān)系(P<0.01)。 9.川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細(xì)胞胞內(nèi)Bcl-2蛋白，P-53蛋白，Caspase-3蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞經(jīng)處理后，經(jīng)細(xì)胞爬片、沖洗和固