川芎嗪二苯甲基哌嗪對氧化損傷血管內(nèi)皮細胞的保護作用研究.pdf

1、本實驗采用過氧化氫作為外源性自由基生成系統(tǒng)，模擬血管內(nèi)皮細胞的脂過氧化損傷，建立離體培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞(ECV-304)氧化應激損傷模型，觀察川芎嗪二苯甲基哌嗪對氧化損傷的血管內(nèi)皮細胞的保護作用及其可能的機制，其用于心、腦血管疾病治療提供進一步的資料，同時也為傳統(tǒng)中藥的開發(fā)提供新思路。 1. 川芎嗪二苯甲基哌嗪對H2O2氧化損傷ECV-304細胞活性的影響 采用MTT法測定細胞活性。實驗結(jié)果顯示，ECV-304細胞氧化損

2、傷后，細胞活力顯著降低(P<0.01)。經(jīng)川芎嗪二苯甲基哌嗪10、50、100μmol/L處理后細胞活力明顯增強(P<0.01)。 2．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細胞培養(yǎng)液LDH釋放率的影響收集氧化損傷處理后的：ECV-304細胞培養(yǎng)上清液和細胞裂解液，參照試劑盒說明分別測定培養(yǎng)上清液和細胞裂解液中的LDH活性，計算細胞LDH釋放率。實驗結(jié)果表明，ECV-304細胞經(jīng)H<,2>O<,2>損傷后

3、，細胞活力降低，細胞膜通透性增加，胞內(nèi)LDH漏出增多，培養(yǎng)液中LDH活力顯著增加(P<0.01)。經(jīng)川芎嗪二苯甲基哌嗪50、100 μmol/L處理后，細胞LDH釋放顯著減少(P<0.01)。 3．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細胞培養(yǎng)液中MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力的影響收集氧化損傷處理后的ECV-304細胞培養(yǎng)上清液。參照MDA、SOD、GSH-Px檢測試劑盒說明分別測定細胞MDA

4、含量、SOD活力、GSH-Px活力。實驗結(jié)果表明，氧化損傷后胞內(nèi)MDA含量顯著增加(P<0.01)，SOD活力與GSH-Px活力顯著降低(P<0.01)。經(jīng)川芎嗪二苯甲基哌嗪10、50、100μmol/L處理后，細胞MDA含量顯著減少(P<0.01)；SOD活力和GSH-Px活力均顯著升高(P<0.01)。 4．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H202氧化損傷ECV-304細胞ROS的影響細胞經(jīng)處理后制備細胞懸液，以：DCFH-DA負載細胞

5、。將細胞懸液分成六組：正常組、模型組及各濃度藥物作用組，依次加到96孔板中，置多功能酶標儀檢測熒光值(λ<,ex>=488nm，λ<,em>=525nm)。按公式計算ROS。實驗結(jié)果表明，H<,2>O<,2>氧化損傷后胞內(nèi)：ROS濃度顯著升高(P<0.01)，而川芎嗪二苯甲基哌嗪10、50、100μmol/L能明顯降低氧化受損細胞內(nèi)的ROS濃度(P<0.05)。 5．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304

6、細胞染色質(zhì)的影響細胞經(jīng)處理后，以多聚甲醛室溫固定，Hoechst 33258染色并于熒光顯微鏡下觀察并拍照。實驗結(jié)果表明，細胞經(jīng)Hoechst 33258染色后，正常組細胞核較大且染色均勻；模型組細胞核內(nèi)可見致密的顆粒狀熒光，呈現(xiàn)出凋亡細胞典型的核固縮、核碎裂表現(xiàn)；川芎嗪二苯甲基哌嗪各濃度組細胞的胞核形態(tài)趨于正常，且凋亡細胞數(shù)隨劑量增加而減少。 6．川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細胞凋亡率的影響細

7、胞經(jīng)處理后，以Annexin V-FITC/PI雙染后上流式細胞儀檢測。實驗結(jié)果表明，與正常組比較，模型組細胞的凋亡率明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，川芎嗪二苯甲基哌嗪各濃度組細胞的凋亡率降低，且呈劑量依賴性關(guān)系，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 7.川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細胞胞內(nèi)鈣離子濃度的影響制備細胞懸液，以Fura-2/AM負載。將細胞懸液分成六組：正常組、模型組及各濃

8、度藥物作用組依次加到96孔板中，置多功能酶標儀檢測λ<,ex>=340 nm/λ<,em>=510 nm和λ<,ex>=380 nm/λ<,em>=510 nm處熒光比值。按公式計算[Ca<'2+>]<,i>。實驗結(jié)果表明，ECV-304細胞氧化損傷后胞內(nèi)游離鈣離子濃度顯著升高(P<0.01)，而川芎嗪二苯甲基哌嗪50、100 μmol/L能顯著抑制胞內(nèi)鈣濃度(P<0.01)。 8.川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損

9、傷ECV-304細胞線粒體膜電位的影響細胞經(jīng)處理后，經(jīng)Rh123染色后上流式細胞儀檢測。實驗結(jié)果表明，與正常組比較，模型組細胞線粒體膜電位明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，川芎嗪二苯甲基哌嗪組細胞線粒體膜電位顯著升高，且呈劑量依賴性關(guān)系(P<0.01)。 9.川芎嗪二苯甲基哌嗪對H<,2>O<,2>氧化損傷ECV-304細胞胞內(nèi)Bcl-2蛋白，P-53蛋白，Caspase-3蛋白表達的影響細胞經(jīng)處理后，經(jīng)細胞爬片、沖洗和固