4種牛病毒性傳染病的定性及定量PCR檢測(cè)方法.pdf

1、本研究建立了牛地方流行性白血病病毒(BLV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(BHV1)、牛病毒性腹瀉粘膜病毒(BVDV)和赤羽病病毒(AKV)各種病毒單一的PCR檢測(cè)方法，分別擴(kuò)增BLV gp51基因341bp的片段、BHV1 gB基因478bp的片段、BHV1 gE基因271bp片段、AKV S RNA365bp片段和BVDV的UTR基因289bp的片段。 考慮到BLV通常都以前病毒(DNA病毒)的形式整合于宿主細(xì)胞的情況，本研究建立

2、了BLV前病毒和BHV1同步PCR檢測(cè)方法，同步擴(kuò)增BLV gp51基因341bp的片段和BHV1 gB基因478bp的片段。 本研究建立了BVDV和AKV兩種RNA病毒同步PCR檢測(cè)方法，分別選取AKV和BVDV特異性引物AKVf1/AKVrl和BVDVf1/BVDVr1，建立兩種RNA病毒同步RT-PCR反應(yīng)體系，可以同步擴(kuò)增AKV基因的365bp的片段和BVDV的UTR基因289bp的片段。根據(jù)BLV高度保守的gp51基因

3、序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物及其相應(yīng)的Taqman探針，建立并優(yōu)化反應(yīng)體系，該方法與AKV、BVDV、IBR等均無交叉反應(yīng)，在對(duì)已知拷貝數(shù)的含BLV質(zhì)粒的擴(kuò)增中，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到260個(gè)拷貝/μL，比用常規(guī)PCR對(duì)相同模板進(jìn)行擴(kuò)增的靈敏度高1000倍。本方法簡便、快速，從核酸提取到獲得結(jié)果只需3h。構(gòu)建了含牛地方流行性白血病病毒(BLV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(BHV1)、牛病毒性腹瀉粘膜病毒(BVDV)和赤羽病病毒(AKV)四種病毒相關(guān)基因的

4、載體質(zhì)粒作為病毒DNA或RNA陽性對(duì)照，研制了牛地方流行性白血病病毒(BLV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒( BHV1)、牛病毒性腹瀉粘膜病毒(BVDV)和赤羽病病毒(AKV)各種單一病毒的PCR檢測(cè)試劑盒，以及BLV前病毒和BHV1二重PCR檢測(cè)試劑盒和AKV和BVDV單管二重RT-PCR檢測(cè)試劑盒。對(duì)試劑盒的重復(fù)性結(jié)果表明，各個(gè)試劑盒重復(fù)性較好，但反復(fù)凍融會(huì)有所影響，因此推薦開啟后盡快一次用完。保存期試驗(yàn)結(jié)果表明，試劑盒在-20℃能保存六