兩種蟲媒傳染病自然疫源地調(diào)查與病原特征研究.pdf

1、近年來,全球面臨著新傳染病不斷出現(xiàn)、舊傳染病死灰復(fù)燃的嚴(yán)峻形勢(shì)。除大家熟知的SARS、高致病性禽流感外,新舊蟲媒傳染病的巨大現(xiàn)實(shí)危害也不容忽視。蟲媒傳染病多為自然疫源性疾病,其動(dòng)物宿主、傳播媒介分布廣泛,易在自然界流行,當(dāng)人進(jìn)入疫源地就容易被感染并發(fā)病,因而這些疾病對(duì)在野外從事生產(chǎn)活動(dòng)、經(jīng)濟(jì)開發(fā)、國(guó)防建設(shè)、旅游以及軍事訓(xùn)練等人群存在極大威脅,暴發(fā)流行時(shí)有發(fā)生。蟲媒傳染病的病原體種類繁多,包括病毒、細(xì)菌、立克次體、螺旋體以及寄生蟲等,并且

2、一種媒介或動(dòng)物宿主可攜帶兩種或兩種以上病原體,使其傳播變得更加復(fù)雜。此外,自然災(zāi)害的發(fā)生、自然環(huán)境的破壞以及局部環(huán)境的改變都會(huì)影響蟲媒傳染病的發(fā)生及流行。
　　由于我國(guó)自然地理?xiàng)l件復(fù)雜,環(huán)境多樣,動(dòng)植物區(qū)系豐富,所以蟲媒傳染病的種類也十分豐富。近年來,新發(fā)蟲媒傳染病的出現(xiàn)和流行給我國(guó)公共衛(wèi)生領(lǐng)域造成了嚴(yán)重威脅,尤其是蜱媒傳染病。如嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體病的出現(xiàn)及其疫源地的活躍,新型布尼亞病毒的發(fā)現(xiàn)及其引起的發(fā)熱伴血小板減少綜合癥的暴發(fā)流

3、行。因此,針對(duì)這些新發(fā)或再發(fā)的蟲媒傳染病開展深入研究,摸清其疫源地本底情況及流行規(guī)律,掌握病原特征及其與宿主、媒介之間的相互作用,才能為疾病的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)和理論支持。
　　無(wú)形體病是無(wú)形體科病原微生物感染而引起的相關(guān)疾病的統(tǒng)稱,是一種蜱媒傳染病,主要包括人單核細(xì)胞埃立克體病、人嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體病以及人埃文氏埃立克體病。2006年我國(guó)安徽某地區(qū)出現(xiàn)人嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體病小暴發(fā),報(bào)道了10例疑似病例,并懷疑該病原體可能通過人—

4、人傳播。但此后國(guó)內(nèi)相關(guān)研究并未發(fā)現(xiàn)無(wú)形體病確診病例。我國(guó)東北林區(qū)是一個(gè)重要的蟲媒傳染病自然疫源地,媒介和動(dòng)物宿主分布廣泛,蟲媒病原體種類豐富。本研究室于2009年從吉林省的鼠和羊中分離培養(yǎng)到嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體,提示當(dāng)?shù)乜赡艽嬖跓o(wú)形體感染病例。
　　本研究于2010年在黑龍江省牡丹江地區(qū)開展流行病學(xué)調(diào)查,主要針對(duì)有蜱咬史并有發(fā)熱癥狀的病例,結(jié)果在當(dāng)?shù)匕l(fā)現(xiàn)了7例新埃立克體感染病例。新埃立克體是隸屬于無(wú)形體科的一種新發(fā)蜱傳病原體,目前僅在

5、歐洲有少數(shù)散發(fā)病例報(bào)道,本研究首次在我國(guó)乃至亞洲地區(qū)報(bào)道了一組新埃立克體感染病例。本研究還進(jìn)一步開展了新埃立克體自然疫源地調(diào)查并分析了其病原特征。
　　在使用恒河猴分離培養(yǎng)新埃立克體的試驗(yàn)中,本研究發(fā)現(xiàn)恒河猴感染了五日熱巴爾通體。五日熱巴爾通體是戰(zhàn)壕熱的致病菌,是一種潛在的生物戰(zhàn)劑,也是一種再發(fā)的蟲媒病原體。人是五日熱巴爾通體的主要宿主,體虱為主要傳播媒介,蜱能否傳播該病原體尚存爭(zhēng)議。本研究進(jìn)一步調(diào)查了猴中五日熱巴爾通體的感染情況

6、,證明了猴是該病原體的動(dòng)物宿主,并鑒定了傳播媒介。此外,通過多位點(diǎn)序列分型和全基因組測(cè)序方法分析了五日熱巴爾通體的遺傳進(jìn)化特征。
　　主要研究結(jié)果:
　　1.我國(guó)東北地區(qū)人群新埃立克體感染調(diào)查研究
　　本研究采用哨點(diǎn)醫(yī)院監(jiān)測(cè)和實(shí)驗(yàn)室研究相結(jié)合的方法開展人群蜱媒病原體感染調(diào)查。2010年5月至7月期間,在我國(guó)東北部的黑龍江省牡丹江市林業(yè)中心醫(yī)院開展調(diào)查,共納入628例有蜱咬史并有發(fā)熱癥狀病例。采用針對(duì)rrs基因的通用PC

7、R和針對(duì)groEL基因的特異性PCR方法,從7例病例的急性期血液標(biāo)本中檢測(cè)到新埃立克體。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)本研究獲得的新埃立克體rrs和groEL基因序列與俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)及西伯利亞地區(qū)已報(bào)道的序列一致。
　　臨床資料分析發(fā)現(xiàn)7例新埃立克體感染病例均有發(fā)熱、頭痛和乏力癥狀,其它常見癥狀包括惡心、嘔吐、肌痛和頸痛,偶見癥狀包括關(guān)節(jié)炎、咳嗽、腹瀉、意識(shí)模糊和紅斑;實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)結(jié)果顯示1例白細(xì)胞減少,1例白細(xì)胞升高,2例血小板減少,2例貧血;血清

8、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶均正常。歐洲報(bào)道的散發(fā)病例多為免疫受損者,感染新埃立克體后臨床癥狀均較重,而本研究發(fā)現(xiàn)的7例病例既往健康,其臨床特征更能代表健康人群感染新埃立克體后的癥狀。
　　本研究在發(fā)現(xiàn)新埃立克體感染病例后,對(duì)病例居住地周圍的媒介蜱和鼠開展了流行病學(xué)調(diào)查。2010年5月至7月期間,共調(diào)查516只游離蜱,總感染率為1.6％,其中全溝硬蜱為1.9%(6/316),嗜群血蜱為0.8%(2/187),森林革蜱為0(

9、0/13);共調(diào)查211只鼠,總感染率為3.8%,其中棕背平鼠為4.6%(5/109),褐家鼠為5.7%(2/35),花鼠為33.3%(1/3),大林姬鼠、黑線姬鼠及小家鼠感染率均為0。媒介蜱和鼠中新埃立克體感染的發(fā)現(xiàn)證明我國(guó)東北地區(qū)為新埃立克體自然疫源地。
　　2.我國(guó)鼠中新埃立克體感染情況調(diào)查及遺傳進(jìn)化特征分析
　　本研究從我國(guó)11個(gè)地區(qū)的15個(gè)調(diào)查點(diǎn)共采集841只野鼠,涵蓋10個(gè)屬22個(gè)種。其中黑線姬鼠所占比率最高,占

10、14.6%;其次是褐家鼠和棕背平鼠,分別占10.3%和9.9%。通過對(duì)鼠脾臟組織提取的基因組DNA進(jìn)行針對(duì)16SrRNA和groEL基因的巢氏PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)34只鼠感染了新埃立克體,涵蓋9個(gè)鼠種,包括西南絨鼠、花鼠、中華姬鼠、小林姬鼠、黑線姬鼠、大林姬鼠、棕背平鼠、社鼠和褐家鼠,感染率為1.1%~25.0%。其中西南絨鼠(25.0%,P=0.038)、小林姬鼠(12.5%,P=0.019)和黑線姬鼠(12.0%,P<0.001)感染率

11、較其它鼠種高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究的15個(gè)調(diào)查點(diǎn)中,有10個(gè)調(diào)查點(diǎn)均檢測(cè)到新埃立克體,涵蓋7個(gè)調(diào)查地區(qū),分別是黑龍江、吉林、河南、浙江、福建、云南和內(nèi)蒙古,感染率為1.5%~13.8%。Fisher’s精確檢驗(yàn)表明不同地區(qū)鼠中新埃立克體感染率有差異(P<0.001),其中吉林地區(qū)鼠的感染率最高,為13.8%。
　　經(jīng)序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)我國(guó)存在三種新埃立克體基因型,分別來自東北、東南和西南地區(qū)。選擇GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中所有

12、已注冊(cè)的新埃立克體groEL基因較長(zhǎng)核苷酸序列(874bp)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)新埃立克體共有四類基因型,并且其分布與地理來源相關(guān)聯(lián)。我國(guó)東北及俄羅斯亞洲地區(qū)來源的新埃立克體歸為ClusterI。我國(guó)西南和東南地區(qū)來源的新埃立克體分別歸為ClusterIII和ClusterIV,并且日本來源的也被劃分到這兩類。此外,歸類到ClusterII的新埃立克體均來自歐洲?；趓rs(1303bp)基因的遺傳進(jìn)化分析同樣顯示新埃立克體有四類基因型

13、,結(jié)果與基于groEL基因的遺傳進(jìn)化分析一致。
　　3.猴中五日熱巴爾通體感染與傳播調(diào)查研究
　　采用PCR擴(kuò)增、血涂片染色、透射電子顯微鏡觀察以及血培養(yǎng)方法從10只恒河猴中檢測(cè)到4只感染了五日熱巴爾通體。本研究進(jìn)一步采用PCR和血培養(yǎng)方法調(diào)查了我國(guó)5個(gè)地區(qū)2種猴中五日熱巴爾通體感染情況,共調(diào)查636只猴,包括恒河猴328只、食蟹猴308只。經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有96只猴(15.1%)感染五日熱巴爾通體,包括恒河猴59只、食蟹猴

14、37只;經(jīng)血培養(yǎng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有53只猴(8.3%)感染五日熱巴爾通體,包括恒河猴37只、食蟹猴16只。恒河猴的感染率高于食蟹猴,但兩種猴的血液帶菌量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。5個(gè)地區(qū)的猴中均有檢測(cè)到五日熱巴爾通體,并且南陽(yáng)市的猴中五日熱巴爾通體感染率較其它地區(qū)高(P<0.001)?？ǚ綑z驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)幼年猴(≤3歲)、青年猴(4~6歲)較成年猴(≥7歲)的感染率高(P<0.05);猴中五日熱巴爾通體的感染率與性別無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)。

15、
　　通過對(duì)10只恒河猴的連續(xù)監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)猴中存在五日熱巴爾通體感染的傳播,檢查恒河猴體表,發(fā)現(xiàn)均有體虱寄生,且體虱均感染了五日熱巴爾通體,推斷可能為猴中五日熱巴爾通體的傳播媒介。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析和形態(tài)學(xué)觀察,鑒定該傳播媒介為鈍猴虱。本研究將五日熱巴爾通體分離株接種到本底干凈的實(shí)驗(yàn)恒河猴,連續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)恒河猴無(wú)明顯臨床癥狀,僅表現(xiàn)為長(zhǎng)期慢性感染,表明猴能較好適應(yīng)該病原體。這些研究結(jié)果表明猴是五日熱巴爾通體的動(dòng)物宿主,鈍猴虱可能為傳播媒介

16、。此外,通過對(duì)8名猴飼養(yǎng)員的兩次調(diào)查,發(fā)現(xiàn)4名出現(xiàn)五日熱巴爾通體抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)現(xiàn)象,表明五日熱巴爾通體可能會(huì)經(jīng)猴傳播給人,需對(duì)其潛在危險(xiǎn)加以重視。
　　4.五日熱巴爾通體的遺傳進(jìn)化特征分析
　　本研究采用MLST技術(shù)分析了53株猴來源五日熱巴爾通體,與已報(bào)道的人來源五日熱巴爾通體相關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)44個(gè)新的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),25個(gè)新的等位基因型,14個(gè)新的序列型(ST8~ST21),表明猴來源的五日熱巴爾通體基因多樣性更為豐富

17、。采用eBURST軟件分析各個(gè)序列型之間的親緣關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的克隆復(fù)合體以及3個(gè)新的單個(gè)型?；贛LST數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)人來源、恒河猴來源以及食蟹猴來源的五日熱巴爾通體分別聚在不同分枝,并且兩種猴來源的菌株進(jìn)化關(guān)系更為接近,表明五日熱巴爾通體的基因多樣性與宿主種類存在關(guān)聯(lián)。采用Splitstree4軟件的splits decomposition analysis和phitest方法分析五日熱巴爾通體各ST型的串聯(lián)序列,發(fā)現(xiàn)

18、五日熱巴爾通體并未發(fā)生基因重組。
　　為進(jìn)一步了解五日熱巴爾通體的遺傳進(jìn)化特征,本研究采用羅氏454測(cè)序和Solexa測(cè)序相結(jié)合的方法測(cè)定了一株猴來源菌株(str.RM-11)的全基因組序列,拼接、組裝、注釋并提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),注冊(cè)號(hào)為CP003784。全基因組序列初步比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)猴來源菌株與人來源菌株(str.Toulouse)存在一定差異,但需要進(jìn)一步深入分析探討其科學(xué)意義。
　　主要結(jié)論:
　　首次在我國(guó)

19、發(fā)現(xiàn)了一組新埃立克體感染病例,確認(rèn)我國(guó)東北地區(qū)為新埃立克體自然疫源地。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)多個(gè)地區(qū)多個(gè)鼠種均存在新埃立克體自然感染,表明該病原體在我國(guó)分布廣泛。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)新埃立克體的基因多樣性可能與地理來源相關(guān)聯(lián)。
　　流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)多個(gè)地區(qū)猴中均存在五日熱巴爾通體感染。首次發(fā)現(xiàn)猴中五日熱巴爾通體感染的傳播,并確認(rèn)鈍猴虱是其傳播媒介。多方面研究結(jié)果有力證明猴是五日熱巴爾通體的動(dòng)物宿主。血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)猴攜帶的五日熱巴爾通