湖羊FSHR和TGF-β1基因核心啟動子區(qū)鑒定與表達(dá)調(diào)控.pdf

1、湖羊是我國珍稀的少數(shù)幾個高繁殖力綿羊品種之一，同時也是農(nóng)業(yè)部首批138個國家級畜禽遺傳資源保護(hù)品種之一，產(chǎn)于太湖流域，具有產(chǎn)羔多、全年發(fā)情、早期生長快、性成熟早、耐濕熱、宜舍飼和肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美等特點(diǎn)。揭示湖羊高繁殖力性狀形成的分子機(jī)理，篩選影響湖羊多胎性狀的關(guān)鍵基因和功能SNP，對湖羊高繁殖力優(yōu)良種質(zhì)特性的保護(hù)和創(chuàng)新利用等具有重要的意義。本研究以湖羊?yàn)檠芯繉ο?，采用PCR擴(kuò)增及克隆測序技術(shù)分別得到湖羊FSHR和TGF-β1基因編碼區(qū)序列，

2、采用生物信息學(xué)軟件對其序列特征進(jìn)行分析;克隆湖羊FSHR和TGF-β1基因5'調(diào)控區(qū)序列，構(gòu)建缺失表達(dá)載體，利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)篩選其核心啟動子區(qū);通過對多、單羔組湖羊FSHR和TGF-β1基因核心啟動子區(qū)測序篩選SNP，并分析核心啟動子區(qū)的表達(dá)調(diào)控。研究結(jié)果為探索湖羊卵泡顆粒細(xì)胞中FSHR和TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，揭示湖羊高繁殖力性狀形成的分子機(jī)制等提供理論依據(jù)。
　　全文主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過克隆測

3、序獲得了湖羊FSHR基因編碼區(qū)全序列，全長為2088 bp，編碼蛋白含有696個氨基酸殘基，同源性比對發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與其它哺乳動物的一致性在75-97％之間。結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)湖羊FSHR蛋白含有典型的LRR結(jié)構(gòu)域。研究結(jié)果說明湖羊與哺乳動物其它物種FSHR基因在進(jìn)化上是比較保守的，推測湖羊FSHR基因與哺乳動物其它物種一樣，在卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
　　(2)通過克隆測序獲得了湖羊FSHR基因5'調(diào)控區(qū)序列，長度為1920bp。

4、構(gòu)建湖羊FSHR基因5'調(diào)控區(qū)3個缺失表達(dá)載體（pFSHR-497、pFSHR-735、pFSHR-1459，并瞬時轉(zhuǎn)染COV434細(xì)胞和COS-7，熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)pFSHR-735載體的熒光素酶活性極顯著高于其他載體(P＜0.01)，說明湖羊FSHR基因核心啟動子區(qū)位于-743nt～-505nt。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)核心啟動子區(qū)含有YY1、AP-1、USF、Sp1及HSF等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　(3)通過對多、單羔組DNA

5、池測序在湖羊FSHR基因核心啟動子區(qū)-575nt處發(fā)現(xiàn)一個SNP即-575A＞G突變位點(diǎn)。為了進(jìn)一步研究湖羊FSHR基因核心啟動子區(qū)-575A＞G突變對啟動子區(qū)活性的影響及其機(jī)制，我們構(gòu)建了野生型（AA）與突變型(GG)啟動子區(qū)熒光素酶報告基因載體（pFSHR-AA和pFSHR-GG），瞬時轉(zhuǎn)染COV434和COS-7細(xì)胞細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變型啟動子區(qū)活性顯著低于與野生型(P＜0.05)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在湖羊FSHR基因核心啟動子區(qū)含

6、有轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合位點(diǎn)，了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子YY1對湖羊FSHR基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，我們將轉(zhuǎn)錄因子YY1的過表達(dá)載體pUC57-YY1與pFSHR-AA共轉(zhuǎn)染COV434細(xì)胞，熒光素酶表達(dá)活性發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子YY1過表達(dá)后，F(xiàn)SHR基因啟動子區(qū)活性極顯著上升(P＜0.01)。另外，湖羊FSHR基因核心啟動子區(qū)-575A＞G突變使突變型啟動子區(qū)增加了一個新的CpG位點(diǎn)，為了分析DNA甲基化對突變型啟動子區(qū)活性的影響，我們用體外甲基轉(zhuǎn)移酶M.SssI處

7、理pFSHR-GG，使CpG位點(diǎn)甲基化，并瞬時轉(zhuǎn)染COV434細(xì)胞，熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)-575nt處CpG位點(diǎn)甲基化后啟動子區(qū)活性極顯著下降(P＜0.01)。研究結(jié)果說明湖羊FSHR基因核心啟動子區(qū)活性受堿基突變、轉(zhuǎn)錄因子YY1和DNA甲基化調(diào)控。
　　(4)通過克隆測序獲得了湖羊TGF-β1基因編碼區(qū)全序列，全長為1173 bp，編碼蛋白含有390個氨基酸殘基，同源性比對發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與其它哺乳動物的一致性在89-99％之間

8、。結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)湖羊TGF-β1蛋白含有典型的TGF-β前肽(Ala28-Met261)和TGF-β like(Glu290-Ser390)等結(jié)構(gòu)域。研究結(jié)果說明湖羊與哺乳動物其它物種TGF-β1基因在進(jìn)化上是比較保守的，推測湖羊TGF-β1基因與哺乳動物其它物種一樣，在卵泡發(fā)育和排卵中發(fā)揮重要作用。
　　(5)通過克隆測序獲得了湖羊TGF-β1基因5'調(diào)控區(qū)序列，長度為1620bp。構(gòu)建湖羊TGF-β1基因5'調(diào)控區(qū)4個缺失表達(dá)

9、載體(pTGF-β1-188、pTGF-β1-341、pTGF-β1-540和pTGF-β1-1571)，瞬時轉(zhuǎn)染COV434細(xì)胞，熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)pTGF-β1-540載體的熒光素酶活性極顯著高于其他載體，說明湖羊TGF-β1基因核心啟動子區(qū)位于-439nt～-638nt。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)核心啟動子區(qū)含有HSF、Sp1、AP-2、ADR1及HSF2等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。遺憾的是，多、單羔組DNA池測序并未在湖羊TGF-β1基因核心啟動