OATP-B和OATP-D的mRNA及其蛋白在肺癌中表達的定量研究及意義.pdf

1、目的：建立用熒光定量RT—PCR法檢測肺癌組織中人類有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（organic anion transporting polypeptide，OATP）B和 D mRNA的表達，并用免疫組化及圖像分析技術定量分析肺癌組織中蛋白表達水平，分析其mRNA及蛋白表達與病理分型等臨床資料的關系。 方法： 1.熒光定量PCR標準曲線的建立及優(yōu)化： （1）組織總RNA提取：用Tiozol試劑分別提取不同病理分型肺癌組

2、織和正常肺組織中的總RNA。 （2）cDNA的合成：以所提取的組織的總RNA為原料進行逆轉(zhuǎn)錄反應，獲得cDNA。 （3）PCR反應及重組質(zhì)粒的構建：以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進行普通PCR擴增。擴增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收法進行純化。用PGEM—T Easy質(zhì)粒載體連接PCR純化產(chǎn)物，構建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，藍白斑篩選重組質(zhì)粒。 （4）標準曲線的建立及優(yōu)化：優(yōu)化熒光定量PC

3、R體系和條件，以重組質(zhì)粒為標準品建立檢測OATP mRNA的標準曲線，并以此對40例肺癌標本中OATP—B和OATP—D mRNA的含量進行測定。 2.免疫組化：采用鏈霉親和素—過氧化酶法（S—P法），DAB顯色液顯色，以抗OATP—B和抗OATP—D為一抗，PBS作為陰性對照，鑒定肺癌中OATP—B和OATP—D蛋白的表達。用IPP4.0圖像分析軟件對免疫組化結果進行分析。 3.臨床資料分析：結合臨床資料，分析OATP

4、—B和OATP—D的mRNA及蛋白表達與病理分型、性別、年齡、腫瘤大小以及有無淋巴結轉(zhuǎn)移等的關系。 4.統(tǒng)計學分析：采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件包對所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)均用X±S表示，多組均數(shù)間的比較采用方差分析，多組均數(shù)間的兩兩比較采用q檢驗。P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。 結果：構建了OATP基因的重組質(zhì)粒，并且成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選提取重組質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行梯度稀釋，以

5、稀釋的質(zhì)粒為模板優(yōu)化熒光定量PCR體系和條件，建立定量檢測OATP—B和OATP—D mRNA的最佳熒光定量PCR體系。熒光定量PCR結果顯示，OATP—B和OATP—D的mRNA在不同病理分型肺癌中表達上調(diào)，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義；OATP—B和OATP—D的mRNA在有無淋巴結轉(zhuǎn)移肺癌中的表達差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。免疫組化法顯示，與正常肺組織相比，OATP—B和OATP—D蛋白在不同病理分型肺癌中高表達，P<0.0

6、5，差異有統(tǒng)計學意義；OATP—B和OATP—D蛋白在有淋巴結轉(zhuǎn)移肺癌中的表達明顯無高于淋巴結轉(zhuǎn)移肺癌，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。OATP—B和OATP—D的mRNA及其蛋白在不同病理分型、性別、年齡及不同大小肺癌標本間的表達無統(tǒng)計學差異，P>0.05。 結論： 1.建立并優(yōu)化檢測OATP—B和OATP—DmRNA表達的熒光定量PCR體系。2.OATP—B和OATP—D的mRNA及其蛋白在不同病理分型肺癌及淋巴結轉(zhuǎn)