miR-206-miR-613對OATP1B1基因和蛋白表達(dá)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　miRNA是一類長度約為19~25個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，通過與靶基因mRNA3'端非編碼區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)特定序列的堿基互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。本課題組前期研究圍繞“miRNA-PXR-OATP1B1”通路開展，結(jié)果發(fā)現(xiàn) PXR的蛋白表達(dá)量受 miR-148a轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的影響，且可間接調(diào)控OATP

2、1B1的表達(dá)。我們通過生物信息學(xué)軟件Targetscan、miRBase、miRanda及RNA Hybrid預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-206/miR-613種子序列與OATP1B1 mRNA3'-UTR互補(bǔ)配對，具有較高的特異性，且它們之間形成的二級結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。那么，miR-206/miR-613能否調(diào)控OATP1B1蛋白表達(dá)，其作用機(jī)制是否與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)，已引起了我們的高度關(guān)注。故而本研究擬借助分子生物學(xué)技術(shù)，探究miR-206/miR

3、-613對 OATP1B1基因和蛋白表達(dá)的影響，闡明其作用機(jī)制，為OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)能力的改變而引起的藥物反應(yīng)個體差異研究提供新的思路。
　　目的：
　　研究miR-206/miR-613對HepG2細(xì)胞中OATP1B1的 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響；基于miRNA靶向作用OATP1B1 mRNA3'-UTR，深入探索miR-206/613影響OATP1B1表達(dá)的機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用生物信息學(xué)軟件根

4、據(jù) miRNA種子序列與 OATP1B1 mRNA3'-UTR互補(bǔ)結(jié)合的方式及結(jié)合位點(diǎn)最小自由能預(yù)測和篩選出可能靶向作用于OATP1B1 mRNA3'-UTR的miRNAs；
　　2.分別向HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-206/miR-613擬似物（mimic）或抑制物（inhibitor），運(yùn)用RT-qPCR方法檢測HepG2細(xì)胞中miR-206/miR-613表達(dá)水平，驗(yàn)證過表達(dá)或抑制表達(dá)miR-206/miR-613的Hep

5、G2細(xì)胞細(xì)胞模型是否構(gòu)建成功；
　　3.分別向 HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 miR-206/miR-613 mimic或 inhibitor，運(yùn)用RT-qPCR和Western blot等分子生物學(xué)方法檢測OATP1B1 mRNA及蛋白表達(dá)水平，探究過表達(dá)或抑制表達(dá)miR-206/miR-613對HepG2細(xì)胞OATP1B1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響；
　　4.采用雙熒光報(bào)告基因法，研究miR-206/miR-613作用于OATP

6、1B1表達(dá)的確切機(jī)制：首先，將OATP1B1 mRNA的3'-UTR序列克隆至pMIR-REPORT熒光素酶報(bào)告基因載體中，得到 pMIR/OATP1B1-WT報(bào)告質(zhì)粒，與miR-206/miR-613 mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染至HEK293T或HepG2細(xì)胞中，檢測miR-206/miR-613對報(bào)告基因熒光素酶活性的影響；其次，以定點(diǎn)突變方式突變OATP1B1 mRNA3'-UTR上miR-206/miR-613的結(jié)合位點(diǎn)

7、，繼而克隆、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和檢測熒光素酶活性；再次，比較突變前后熒光素酶活性的差異，從而分析miR-206/miR-613對OATP1B1影響的作用位點(diǎn)；
　　5.數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析：各實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，用Graphpad Prisms v5.0軟件作圖，并用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析比較實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的差異性；統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P>0.05表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

8、br>　　結(jié)果：
　　1.通過Targetscan、miRBase、miRanda及RNA Hybrid等生物信息學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)miR-206/miR-613種子序列與OATP1B1 mRNA3'-UTR互補(bǔ)配對，具有較高的特異性，且它們之間形成的二級結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。
　　2. HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-206 mimic作用48 h后，對照組與miR-206 mimic組miR-206相對表達(dá)水平分別為1.00±0.00

9、、1227.85±142.42，與對照組相比，miR-206表達(dá)水平上調(diào)了1227.85倍；而以miR-206 inhibitor作用HepG2細(xì)胞48 h后，對照組與miR-206 inhibitor組miR-206相對表達(dá)水平分別為1.00±0.00、0.48±0.13，即miR-206表達(dá)水平僅為對照組的0.48倍；與此相同，HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-613 mimic作用48 h后，與對照組相比，miR-613表達(dá)水平上調(diào)了9

10、35.38倍；而以miR-613 inhibitor作用HepG2細(xì)胞48 h后，miR-613表達(dá)水平卻僅為對照組的0.67倍；由此可見，我們已成功建立了過表達(dá)或抑制表達(dá)miR-206/miR-613的HepG2細(xì)胞模型。
　　3. miR-206/miR-613 mimic轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞中OATP1B1 mRNA相對表達(dá)水平分別為1.00±0.00、1.29±0.41、1.05±0.32，各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.

11、05)，而 OATP1B1蛋白相對表達(dá)水平分別為1.00±0.02、0.75±0.02、0.61±0.01，與對照組相比下調(diào)24.7％、38.8%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-206/miR-613 inhibitor轉(zhuǎn)染后的 HepG2細(xì)胞中 OATP1B1 mRNA相對表達(dá)表達(dá)水平分別為1.0±0.00、1.16±0.16、1.17±0.21，各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而OATP1B1蛋白相對表達(dá)水平分別

12、為1.00±0.06、1.25±0.07、1.38±0.08，與對照組相比上調(diào)25%、38.2%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.通過雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，我們發(fā)現(xiàn)miR-206/miR-613 mimic可顯著抑制pMIR/ OATP1B1-WT報(bào)告基因熒光素酶活性，各組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.03、0.65±0.05、0.70±0.03，與對照組相比熒光素酶活性分別下降35%和30%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、（P<0.05）；miR-206/miR-613 inhibitor可誘導(dǎo)熒光素酶活性，各組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.04、1.33±0.12、1.33±0.12，與對照組相比熒光素酶活性分別增加33.1%和32.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而在OATP1B1 mRNA3'-UTR miR-206/miR-613結(jié)合位點(diǎn)突變的報(bào)告基因系統(tǒng)中， miR-206/miR-613 mimic和inhibitor對熒光素

14、酶活性均無影響，各組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.05、1.15±0.14、1.03±0.175和1.00±0.01、0.96±0.04、1.00±0.09，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.本研究建立的過表達(dá)或抑制表達(dá)miR-206/miR-613的HepG2細(xì)胞模型，該模型用于基因和蛋白水平上的實(shí)驗(yàn)研究具有良好的可重復(fù)性。
　　2. miR-206和miR-613對OATP1B1的蛋白表

15、達(dá)具有確切的調(diào)控作用，但對OATP1B1 mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示miR-206和miR-613可能是在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控OATP1B1的蛋白表達(dá)。
　　3. miR-206/miR-613 mimic或inhibitor與OATP1B1 mRNA3'-UTR結(jié)合從而抑制或誘導(dǎo)pMIR/OATP1B1-WT報(bào)告基因的活性，當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-206/miR-613 mimic和inhibitor對報(bào)告基因的活性則無