TCR基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對ERK、ZAP-70信號蛋白表達(dá)及磷酸化影響的研究.pdf

1、目的 T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）對腫瘤抗原的識別為T淋巴細(xì)胞活化提供初始刺激。TCR β的V區(qū)有24個亞家族，在正常情況下，機(jī)體未受任何抗原刺激，正常人T細(xì)胞的TCR β重排應(yīng)是隨機(jī)的，即呈多家族性，各家族的T細(xì)胞均執(zhí)行各自的職能。有研究利用RT-PCR檢測TCR Vβ 24個亞家族的基因片段而了解正常人和肝癌病人的TCRVβT細(xì)胞的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果顯示健康人PBMC中T細(xì)胞受體基因的表達(dá)呈隨機(jī)分布，而肝

2、癌病人的T細(xì)胞對于腫瘤細(xì)胞的刺激卻表現(xiàn)出偏好性。我們以往的研究顯示，肝癌患者TCR Vβ7亞家族對于腫瘤細(xì)胞的刺激表現(xiàn)出偏好性的擴(kuò)增，因此我們推測TCRV Vβ7可能與肝癌患者的腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)。我們在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，TCRVβ7.1基因修飾的T細(xì)胞能有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，在此基礎(chǔ)上本研究構(gòu)建了人TCRVβ7.1真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入人T淋巴細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)一步研究經(jīng)TCR基因修飾的T細(xì)胞信號通路的激活情況，為今后研究轉(zhuǎn)TCR基因治療腫瘤以

3、及研究腫瘤患者T細(xì)胞免疫耐受的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 方法 概括起來說本研究由三部分組成：第一部分為人TCRVβ7.1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；第二部分為研究重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的效率，用流式細(xì)胞儀檢測TCRVβ7.1表達(dá)量；第三部分用ELISA法檢測IL-4、INF-γ的表達(dá)量，用Western Blot方法檢測Erk1/2、Zap-70這兩種蛋白總量及磷酸化水平的改變。 結(jié)果

4、 (1)擴(kuò)增出TCRVβ7.1基因，將其插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1經(jīng)酶切、PCR鑒定顯示插入片段大小正確；DNA測序結(jié)果顯示所構(gòu)建的重組表達(dá)載體序列正確。 (2)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測TCRVβ7.1表達(dá)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞TCRVβ7.1表達(dá)率明顯高于未轉(zhuǎn)染組，說明脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染

5、方法可以有效地將TCRVβ7.1基因轉(zhuǎn)入健康人PBMC并得到有效表達(dá)。 (3)Western Blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TCRVβ7.1基因的PBMC組中ERK1/2，p-ERK蛋白表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。P-ERK1/2蛋白表達(dá)與T激活有關(guān)，而p-Zap-70只有在抗原刺激早期有表達(dá)。ELISA結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組INF-γ水平明顯高于未轉(zhuǎn)染組，而IL-4無明顯改變。 結(jié)論 (1)成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)