應(yīng)用于高通量測(cè)序平臺(tái)的兩端測(cè)序文庫(kù)方法探究.pdf

1、DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)研究中極為重要的研究手段之一。自2005年起，基于高通量測(cè)序技術(shù)的新一代商用測(cè)序儀比原有產(chǎn)品更加快捷與廉價(jià)，取代了Sanger測(cè)序法代表的第一代測(cè)序技術(shù)成為了獲取生物體遺傳信息的常規(guī)方法。不管是開發(fā)新的高通量測(cè)序方法，或者對(duì)現(xiàn)有的商業(yè)平臺(tái)進(jìn)行優(yōu)化，更高的測(cè)序速度與更低的測(cè)序成本是高通量測(cè)序方法的進(jìn)一步發(fā)展的方向。
　　 盡管如此，高通量測(cè)序平臺(tái)存在共通的發(fā)展瓶頸。模板制備以及隨后的文庫(kù)制備過程需要

2、投入大量的人力物力與時(shí)間成本;不僅如此，較大的樣品損失以及較低的通量也是急需克服的問題。本文從優(yōu)化現(xiàn)有方法和開發(fā)新方法兩個(gè)角度如手，旨在解決樣品準(zhǔn)備和文庫(kù)制備過程中的難題。主要研究的內(nèi)容如下:
　　 1.對(duì)模板制備損失十分大的超聲破碎過程進(jìn)行優(yōu)化。研究的內(nèi)容包括應(yīng)用最廣的商用超聲打碎儀CovarisTM的各個(gè)參數(shù)意義的物理分析與實(shí)際檢驗(yàn)，超聲容器材質(zhì)，樣品的濃度，樣品體積，占空比等條件對(duì)超聲結(jié)果的影響，旨在獲得用量最少，損失最小

3、的DNA打碎條件，并使得打碎的DNA片段最為穩(wěn)定集中。所得的優(yōu)化條件組合，穩(wěn)定，集中，并可在新一代超聲平臺(tái)推廣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有三個(gè)方面意義:降低實(shí)驗(yàn)耗材成本;實(shí)現(xiàn)痕量樣品的測(cè)序;減少后續(xù)實(shí)驗(yàn)的步驟。并且對(duì)各參數(shù)的詳細(xì)研究對(duì)于其他應(yīng)用具有較高的參考價(jià)值。
　　 2.兩端測(cè)序文庫(kù)方法的開發(fā)。本研究基于乳液PCR和橋式PCR的原理，設(shè)計(jì)出既保留乳液PCR磁珠高效擴(kuò)增與高通量的特征，又具有橋式PCR簡(jiǎn)便性的文庫(kù)制備方法。該方法引入了兩個(gè)高

4、效的工具酶，穩(wěn)定的實(shí)現(xiàn)了乳液包含的磁珠表面的單步橋式PCR，并可通過不同的接頭從片段的兩端進(jìn)行測(cè)序。這樣，該方法不僅集合了現(xiàn)有商業(yè)平臺(tái)文庫(kù)制備方法的優(yōu)點(diǎn)，又可以通過兩端測(cè)序?qū)F(xiàn)有測(cè)序儀器的讀長(zhǎng)增加一倍。具體的工作包括工具酶的選擇與酶促動(dòng)力學(xué)的探究;兩端測(cè)序方法的建立;優(yōu)化傳統(tǒng)乳液PCR過程以適用于新的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是確立了固液界面上核酸內(nèi)切酶V與堿性磷酸酶的反應(yīng)效率，并且制得了兩端測(cè)序文庫(kù)，并驗(yàn)證了其在高通量測(cè)序平臺(tái)上應(yīng)用的可行性。