吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對(duì)2型糖尿病大鼠胰鳥(niǎo)β細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:英國(guó)前瞻性糖尿病研究(UKPDS)結(jié)果表明,2型糖尿病患者在初診時(shí),胰島功能多已低于正常的50％,并隨著糖尿病時(shí)間的推移,胰島β細(xì)胞功能呈進(jìn)行性受損。而胰島β細(xì)胞凋亡異常增多是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞數(shù)量減少的重要原因,如何保護(hù)殘存的胰島β細(xì)胞及通過(guò)對(duì)β細(xì)胞的保護(hù)來(lái)延緩糖尿病的進(jìn)展,仍然是糖尿病治療領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　 2型糖尿病體內(nèi)升高的血糖、血脂誘發(fā)體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡并引起氧化應(yīng)激,是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷和糖尿病發(fā)生

2、發(fā)展的一個(gè)重要原因。大量葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增多,促發(fā)氧化應(yīng)激,激活NF-κB途徑,增加了誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的轉(zhuǎn)錄,使NO合成增加。NO可通過(guò)多種途徑引起胰島β細(xì)胞凋亡,同時(shí)過(guò)量的NO可與超氧陰離子結(jié)合生成氧化作用更強(qiáng)的過(guò)氧亞硝基陰離子(peroxynitrite,ONOO-),其對(duì)胰島β細(xì)胞具

3、有超強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可造成β細(xì)胞凋亡,ONOO還可使蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝基化反應(yīng),最終形成產(chǎn)物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT),蛋白質(zhì)被硝基化后,可誘導(dǎo)酶活性喪失、細(xì)胞壞死及凋亡。
　　 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)為二硫氨基酸酯,其分子上含有巰基(thiol)結(jié)構(gòu),具有抗氧化及金屬螯合作用。PDTC可以特異性抑制NF-κB活性,有效抑制氧

4、化應(yīng)激所致的NF-κB的過(guò)度表達(dá),已有多項(xiàng)研究證實(shí),PDTC可降低糖尿病大鼠血糖水平,但其機(jī)制尚不清楚。本研究以高脂喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型,并用PDTC(50mg·kg-1·d-1)干預(yù)1周后,通過(guò)檢測(cè)血糖水平、胰腺組織中SOD和GSH-PX活力、MDA含量、胰腺組織中iNOS表達(dá)和NT的生成以及胰島β細(xì)胞凋亡的情況,旨在整體水平確定PDTC對(duì)糖尿病大鼠的降糖作

5、用及其對(duì)抗氧化應(yīng)激、硝化應(yīng)激對(duì)胰腺β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　 方法:
　　 1：動(dòng)物模型建立、分組及標(biāo)本處理
　　 參照M.J.Reed等方法建立2型糖尿病大鼠模型,37只健康雄性Wistar大鼠,8周齡,體重180-210g,隨機(jī)分為對(duì)照組(NC組)12只和高脂喂養(yǎng)組(HFD組)25只,對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),高脂組給予高脂飼料喂養(yǎng),8周后行糖耐量實(shí)驗(yàn),高脂喂養(yǎng)組證實(shí)出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí),給予一次性腹腔注射鏈脲佐

6、菌素27mg/kg,對(duì)照組大鼠給予同體積檸檬酸緩沖液腹腔注射腹腔注射,各組以原飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。72小時(shí)后測(cè)血糖值,以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L者為2型糖尿病大鼠,證實(shí)造模成功,共成模24只。成模組隨機(jī)取12只給予PDTC50mg/kg/d進(jìn)行腹腔注射治療。正常對(duì)照組和糖尿病組每日給予同體積的生理鹽水腹腔注射。
　　 各組大鼠每周監(jiān)測(cè)血糖和體重。每組大鼠于腹腔注射STZ前后均做口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose to

7、lerance test,OGTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(insulin tolerance test,ITT)。大鼠自采血前一日20:00開(kāi)始禁食,第二日8:00分別從內(nèi)眥靜脈取血3ml,分離血漿,用于檢測(cè)胰島素、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(lo

8、werdensity lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)。PDTC治療1周后處死動(dòng)物,留取胰腺組織分別檢測(cè)超氧化物歧化酶(superoxide diamutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-PX)的活性及丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量,iNOS、NT的表達(dá)及胰島β細(xì)胞凋亡率。

9、　　 2：血糖、胰島素的測(cè)定
　　 采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖,ELISA法測(cè)定胰島素。通過(guò)穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeoestasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)及胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index,ISI)評(píng)價(jià)胰島素抵抗的程度,HOMA-IR=LN(FBG×FINS/22.5)表示胰島素抵抗的程度,胰島素敏感指數(shù)ISI=

10、IN(1/FBG×FINS),表示胰島素敏感性。
　　 3：口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)
　　 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn):給予2g/kg葡萄糖灌胃,分別測(cè)定灌胃后0、30min、60min、90min、120min的血糖、胰島素水平,并計(jì)算每只大鼠葡萄糖曲線下面積(area under the curve,AUC)。
　　 胰島素耐量實(shí)驗(yàn):給予1U/kg生物合成人胰島素腹腔注射,分別測(cè)定各組

11、大鼠注射后0、15min、30min、60min、90min的血糖水平。
　　 4：血脂的測(cè)定
　　 甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)均使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定,游離脂肪酸(FFA)采用Cu2+比色法測(cè)定。
　　 5：胰腺組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的測(cè)定
　　 取胰腺組織200mg,制備10％胰腺組織勻漿,低溫離心機(jī)300

12、0r/min,離心10-15min,留取上清,按照試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定SOD、GSH-Px的活力及MDA含量。
　　 6：大鼠胰島組織形態(tài)學(xué)觀察
　　 取胰尾部分胰腺組織用10％福爾馬林固定24小時(shí)后,梯度酒精脫水,石蠟包埋。石蠟切片,切片厚度為4μm,HE染色觀察胰島的一般形態(tài)學(xué)變化,免疫組化檢測(cè)胰腺組織內(nèi)iNOS的表達(dá)及NT生成量。
　　 7：胰島素與PI雙染色法,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胰島β細(xì)胞凋亡率。
　　

13、 經(jīng)70％乙醇固定的胰腺組織,制備單細(xì)胞懸液,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)和FITC標(biāo)記的胰島素抗體(anti-Insulin/FITC)雙染色法,4℃染色30 min,流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)測(cè)定β細(xì)胞凋亡百分率。
　　 8：統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 計(jì)量資料以-x±s表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,多組間比較采用單因素方差分

14、析(ANOVA),檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1：STZ注射前各組大鼠指標(biāo)比較；
　　 1.1：各組大鼠體重比較實(shí)驗(yàn)初各組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,按照分組喂養(yǎng)不同飼料,實(shí)驗(yàn)第8周,高脂喂養(yǎng)組大鼠體重(body weight,BW)(361.92±19.22g)明顯高于對(duì)照組(313.17±19.95g),差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 1.2：各組大鼠

15、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR、ISI比較實(shí)驗(yàn)第8周高脂喂養(yǎng)組空腹血糖與對(duì)照組相比尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,高脂組大鼠空腹胰島素水平(fasting plasma insulin,FINS)(18.01±2.63μIU/ml)明顯高于對(duì)照組(10.67±0.83μIU/ml),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);高脂喂養(yǎng)組大鼠HOMA-IR(1.22±0.17)高于對(duì)照組(0.68+0.09)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);高脂喂養(yǎng)組大鼠ISI(-

16、4.43±0.17)低于對(duì)照組(-3.79±0.09)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 1.3：各組大鼠口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)及胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)比較STZ注射前,OGTT:對(duì)照組大鼠葡萄糖灌胃后30min血糖達(dá)高峰,高脂喂養(yǎng)組大鼠90min血糖達(dá)高峰,各時(shí)間點(diǎn)血糖水平均較對(duì)照組明顯升高,其中90min、120min兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;高脂組大鼠葡萄糖曲線下面積(AUC)(27.91±2.16)

17、明顯高于正常對(duì)照組(25.65±1.44)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);葡萄糖刺激后β細(xì)胞胰島素釋放功能結(jié)果:高脂組各時(shí)間點(diǎn)胰島素水平較對(duì)照組明顯升高,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 STZ注射前,ITT:高脂喂養(yǎng)組大鼠腹腔注射胰島素后15min、60min、90min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖水平均明顯高于對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 1.4：各組大鼠血脂水平比較高脂組大鼠TC(8.79±1.83mmol

18、/L)、TG(1.12±0.32mmol/L)、LDL(5.65±1.34mmol/L)、FFA(1.84±0.14mEq/L)分別明顯高于正常對(duì)照組TC(2.18±0.11mmol/L)、TG(0.66±0.07mmol/L)、LDL(1.00±0.06mmol/L)、FFA(1.27±0.13mEq/L),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 2：造模后各組大鼠指標(biāo)比較；
　　 2.1：各組大鼠空腹血糖及空腹胰島素

19、比較
　　 8周末,高脂組腹腔注射STZ72h后,高脂組FBG(26.16±3.38mmol/L)明顯高于對(duì)照組(4.41±0.56mmol/L)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。經(jīng)PDTC治療1周后,FBG(11.55±2.89mmol/L)明顯低于糖尿病組(26.55±2.90mmol/L),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01),但仍明顯高于對(duì)照組(5.58±4.43mmol/L)。
　　 2.2：各組大鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGT

20、T)及胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)比較
　　 經(jīng)PDTC治療1周,OGTT結(jié)果顯示:PDTC治療組各時(shí)間點(diǎn)血糖均明顯低于糖尿病組,其中120min時(shí)間點(diǎn)血糖水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),PDTC治療組葡萄糖曲線下面積(63.06±25.27)明顯低于糖尿病組(101.83±16.89)(P＜0.05)。
　　 ITT結(jié)果顯示:PDTC治療組各時(shí)間點(diǎn)血糖明顯低于糖尿病組,其中0min、15min時(shí)間點(diǎn)血糖比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

21、異(P＜0.05)。
　　 2.3：各組大鼠胰腺組織內(nèi)SOD、GSH-Px活力及MDA含量比較
　　 糖尿病組大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px活力明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01),PDTC治療后大鼠胰腺組織SOD、GSH-Px活力明顯高于糖尿病組(P＜0.05或P＜0.01);糖尿病組大鼠的MDA含量明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01),PDTC治療組大鼠的MDA含量明顯低于糖尿病組(P＜0.01)。
　　 2.

22、4：各組大鼠胰島組織形態(tài)學(xué)變化
　　 HE染色顯示:低倍鏡下可見(jiàn)NC組大鼠胰腺胰島形狀規(guī)則,胰島內(nèi)細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核呈紫藍(lán)色,大而圓,核清晰,胞漿豐富;DM組大鼠胰島結(jié)構(gòu)明顯破壞,胰島內(nèi)β細(xì)胞數(shù)量明顯減少,并且β細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)不同程度空泡樣變;PDTC治療組大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)目較糖尿病組明顯增多,胰島結(jié)構(gòu)明顯改善。
　　 免疫組化顯示:糖尿病組大鼠胰腺組織中iNOS表達(dá)及NT的生成量均明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01);PD

23、TC治療組大鼠胰腺組織中iNOS表達(dá)及NT的生成量均明顯低于糖尿病組(P＜0.01)。
　　 2.5：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
　　 胰島β細(xì)胞凋亡率糖尿病組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡率(22.44±5.15％)明顯高于正常對(duì)照組(10.35±1.95％)(P＜0.01);PDTC治療組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡率(12.14±4.66％)明顯低于糖尿病組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1：在高脂飲食喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上,給予小劑