H2S和NO促進(jìn)匍枝筋骨草20E積累的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、匍枝筋骨草（Ajuga lobata）是一種富含甾酮和生物堿等多種活性物質(zhì)的藥用植物。目前，對(duì)筋骨草屬植物中蛻皮激素類似物的應(yīng)用主要集中在昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與醫(yī)藥保健領(lǐng)域的研發(fā)方面，可見來(lái)源于筋骨草屬植物中的蛻皮激素類似物已倍受研究者的關(guān)注。但到目前為止，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)植物蛻皮激素的瓶頸問題依然存在。近年來(lái)的研究主要集中在蛻皮激素的提取與分析方法、蛻皮激素源植物的篩選及新蛻皮激素類似物的鑒定方面，而關(guān)于其基因和蛋白水平的研究卻鮮有報(bào)道。本

2、文以產(chǎn)β-蛻皮甾酮的愈傷組織為材料進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，分析了H2S、NO對(duì)β-蛻皮甾酮積累的調(diào)控作用;然后以H2S、NO兩種信號(hào)分子誘導(dǎo)的匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞為材料，利用Illumina技術(shù)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)H2S、NO、Control樣品分別進(jìn)行了數(shù)字基因表達(dá)譜分析;最后運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從差異表達(dá)基因和差異蛋白層面探討了H2S、NO誘導(dǎo)后匍枝筋骨草細(xì)胞的分子應(yīng)答情況。主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)

3、對(duì)H2S和NO誘導(dǎo)的匍枝筋骨草高產(chǎn)β-蛻皮甾酮細(xì)胞系進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明:1個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，根誘導(dǎo)的愈傷組織干重與β-蛻皮甾酮積累量顯著高于葉誘導(dǎo)的愈傷組織;5代連續(xù)培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞在第4代生長(zhǎng)比較穩(wěn)定。在細(xì)胞培養(yǎng)的第6d加入2mmo1/L NaHS溶液、0.5mmol/L SNP溶液處理12hr，發(fā)現(xiàn)H2S和NO均促進(jìn)了細(xì)胞中β-蛻皮甾酮的積累，過(guò)長(zhǎng)的處理時(shí)間、過(guò)高或過(guò)低的供體溶液濃度均對(duì)細(xì)胞中β-蛻皮甾酮的積累表現(xiàn)抑制作用。
　　

4、2、利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)匍枝筋骨草進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和de novo組裝，并對(duì)得到的Unigenc進(jìn)行了功能注釋、分類及代謝通路分析，結(jié)果表明:得到N50值為934bp、平均長(zhǎng)度為680bp的匍枝筋骨草Unigene共68085條，將其與NCBI的NR和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，分別有46924條和28715條Unigene與其他物種的基因具有同源性。利用COG數(shù)據(jù)庫(kù)可將有關(guān)的15495條匍枝筋骨草的Unige

5、ne分成25個(gè)類別，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)共有26618個(gè)Unigene參與128種代謝通路，在甲羥戊酸途徑和甾族化合物合成途徑分別找到了36個(gè)和64個(gè)與植物蛻皮激素合成相關(guān)的Unigene。
　　3、利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)H2S、NO誘導(dǎo)的匍枝筋骨草cDNA文庫(kù)進(jìn)行了差異基因表達(dá)譜分析，結(jié)果表明:H2S誘導(dǎo)下顯著差異表達(dá)基因（|log2Ratio|≥2）達(dá)3012個(gè)，其中有上調(diào)表達(dá)基因1311個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因170

6、1個(gè);NO誘導(dǎo)下差異表達(dá)基因達(dá)755個(gè)，其中有上調(diào)表達(dá)基因450個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因305個(gè)。H2S處理后差異表達(dá)倍數(shù)在10倍(|log2Ratio|＞10)以上的差異表達(dá)基因有181個(gè)，其中上調(diào)基因140個(gè)，下調(diào)基因41個(gè);NO處理后差異表達(dá)倍數(shù)在10倍以上的差異表達(dá)基因有9個(gè)，且均上調(diào)表達(dá)。對(duì)差異表達(dá)基因的功能注釋表明，它們主要被定位于膜結(jié)構(gòu)上，執(zhí)行分子活性、催化活性和氧化還原酶等功能，參與了對(duì)刺激與脅迫的應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程;此外，在植物

7、蛻皮激素生物合成與代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝產(chǎn)物合成等生物學(xué)過(guò)程分別注釋到不同數(shù)量的差異表達(dá)基因。Pathway代謝通路分析表明，差異表達(dá)基因極顯著地被注釋到代謝途徑與次生代謝產(chǎn)物生物合成2條途徑中。在與植物蛻皮激素合成有關(guān)的甾族化合物和萜類化合物的生物合成途徑中均顯著富集到差異表達(dá)基因。
　　4、利用iTRAQ技術(shù)對(duì)H2S、NO誘導(dǎo)的匍枝筋骨草的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定與分析，結(jié)果表明:H2S誘導(dǎo)后鑒定出差異蛋白364個(gè)，其中上調(diào)蛋白

8、質(zhì)179個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)185個(gè);NO誘導(dǎo)后鑒定出差異蛋白質(zhì)141個(gè)，其中64個(gè)上調(diào)，77個(gè)下調(diào)。對(duì)差異蛋白質(zhì)功能注釋表明，這些蛋白主要被定位于細(xì)胞器中，執(zhí)行催化與結(jié)合功能，參與了代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、刺激響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。對(duì)差異蛋白質(zhì)參與的pathway通路分析表明，它們被顯著富集于代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代謝等途徑上，這些代謝途徑均直接或間接地參與了匍枝筋骨草植物體中的代謝產(chǎn)物的合成與代謝過(guò)程。對(duì)轉(zhuǎn)錄組與