孕酮對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中ERK、CyclinD1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、孕酮對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中ERK、CyclinD1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用前言子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤的20-30％，其發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)。無(wú)孕激素拮抗的雌激素的長(zhǎng)期作用是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)因素。孕激素治療子宮內(nèi)膜癌已有50多年的歷史，隨著分子腫瘤學(xué)研究的發(fā)展，孕激素在體內(nèi)、外抑制子宮內(nèi)膜癌的研究已取得了一定的進(jìn)展，但其作用機(jī)制仍不十分清楚。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為孕激素與細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的孕激素核受體(gen

2、omicprogesteronereceptor，gPR)結(jié)合后調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，通過(guò)mRNA合成特異的蛋白質(zhì)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。近年研究表明，孕激素可在多種細(xì)胞表面與孕激素膜受體(membraneprogesteronereceptor，mPR)結(jié)合，迅速激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮快速的nongenomicaction(本文譯為非基因作用)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法:1.主要試劑與儀器Ishikawa細(xì)胞株；胎牛血清；RPMI1640培養(yǎng)

3、液；孕酮(progesterone，P)；孕激素核受體阻斷劑RU486；鼠抗人磷酸化ERK多克隆抗體；鼠抗人總ERK多克隆抗體；鼠抗人CyclinD1多克隆抗體；生物素標(biāo)記二抗；超凈工作臺(tái)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱；倒置相差顯微鏡；超速低溫離心機(jī)；勻漿機(jī)；分光光度儀；多功能電泳儀；水浴式轉(zhuǎn)印槽；自動(dòng)凝膠成像分析儀。 2實(shí)驗(yàn)方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)將Ishikawa細(xì)胞株置于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPM

4、I1640培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使其貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿后用0.25％胰酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 2.2藥物作用及蛋白提取1)以1×106個(gè)/ml的細(xì)胞密度將Ishikawa細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，生長(zhǎng)至鋪滿85％后，棄去培養(yǎng)液，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液作用24小時(shí)，加入處理因素。 ①P對(duì)ERK、CyclinD1蛋白作用的時(shí)間依賴性：分別用終濃度為接近生理濃度的P(1×10-8mol/L)干預(yù)細(xì)胞，分別培養(yǎng)

5、0、5、15、30、60、120min。 ②P對(duì)ERK、CyclinD1蛋白作用的濃度依賴性：分別用終濃度為1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L的P干預(yù)細(xì)胞30min。 ③RU486對(duì)P作用于Ishikawa細(xì)胞的干擾作用：分別加入終濃度為0、P1×10-8mol/L、P1×10-8mol/L+RU4861×10-6mol/L、RU4861×10-6mol/L干預(yù)細(xì)

6、胞30min，0組細(xì)胞除不加處理因素外，加以等體積的溶媒(1×PBS)。 2)細(xì)胞總蛋白的提取棄去藥物，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞3次，立即加入細(xì)胞裂解液200μl(50mmol/LTris2HCl、10mmol/LEDTA、150mmol/LNaCl、1％Tritonx2100、0.02％NaN3、PMSF0.1mg/ml)，冰上裂解30分鐘，用細(xì)胞刮迅速刮下細(xì)胞，4℃12000rpm離心1h，取上清，按酚試劑法測(cè)定

7、蛋白質(zhì)濃度。置于-70℃冰箱中保存。 3聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡雜交各取20μl細(xì)胞裂解提取物，加入樣品buffer，沸水煮5分鐘變性，將30μg總蛋白質(zhì)上樣至10％SDS-PAGE中，電泳2小時(shí)(電壓為50V)，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)(電壓為50V，100Ma)，封閉1小時(shí)后分別加入一抗和二抗，AP顯色法顯色。 結(jié)果:1.P對(duì)總ERK、p-ERK及CyclinD1蛋白作用的時(shí)間依賴性：1×10-8mol/L

8、的P作用5min后p-ERK蛋白水平明顯下降，作用30min后降到最低，作用60min和120min又明顯升高，CyclinD1蛋白在P作用30min時(shí)表達(dá)下降，作用60min和120min時(shí)上升，總ERK蛋白的水平無(wú)明顯變化。 2.P對(duì)總ERK、p-ERK及CyclinD1蛋白作用的濃度依賴性：隨著P濃度的升高，p-ERK蛋白水平呈下降趨勢(shì)，CyclinD1蛋白水平也呈下降趨勢(shì)，總ERK蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化。 3.RU

9、486對(duì)P作用于Ishikawa細(xì)胞的干預(yù)作用：加入P30min后p-ERK及CyclinD1蛋白水平與對(duì)照組相比明顯下降，同時(shí)加入P和RU486干預(yù)細(xì)胞后p-ERK和CyclinD1蛋白水平與P干預(yù)組無(wú)明顯差別，單獨(dú)加入RU486干預(yù)細(xì)胞后p-ERK和CyclinD1蛋白水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變，4組細(xì)胞中總ERK蛋白的水平無(wú)明顯變化。 討論孕激素屬于甾體類激素家族成員，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為孕激素與位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的gPR結(jié)合

10、后，增強(qiáng)或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生特異的蛋白質(zhì)而發(fā)揮作用，這種作用稱為經(jīng)典的基因作用(clsssicalgenomicaction)，近年來(lái)許多研究表明，孕激素可以與位于細(xì)胞膜表面的mPR結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而發(fā)揮快速的非基因作用(nongenomicaction)。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedkinase，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteink

11、inase，MAPK)家族中的重要成員，主要被各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、腫瘤啟動(dòng)子等激活而磷酸化為p-ERK，進(jìn)入細(xì)胞核作用于細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、c-myc、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，與細(xì)胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。ERK位于胞漿內(nèi)，被激活后迅速穿過(guò)核膜，ERK活化是將信號(hào)從細(xì)胞膜表面?zhèn)鲗?dǎo)至核的關(guān)鍵。目前關(guān)于ERK激活機(jī)制的研究很多，但對(duì)ERK失活的報(bào)道并不多見。 我們的研究

12、結(jié)果顯示，無(wú)任何干預(yù)的Ishikawa細(xì)胞中即有p-ERK和CyclinD1蛋白的表達(dá)，P作用于Ishikawa細(xì)胞5min后p-ERK蛋白的表達(dá)受到明顯抑制，30min時(shí)作用最強(qiáng)。P的這種作用不會(huì)是基因作用，因?yàn)樵?min到30min內(nèi)不可能完成轉(zhuǎn)錄及翻譯的過(guò)程。研究表明甾體類激素與細(xì)胞核中的受體結(jié)合后形成激素受體復(fù)合物，與染色質(zhì)上高親和位點(diǎn)結(jié)合，此后10min內(nèi)開始轉(zhuǎn)錄過(guò)程，30～40min后進(jìn)行翻譯及蛋白質(zhì)形成。因而本研究中P快速

13、的作用不是通過(guò)細(xì)胞核中的gPR，可能通過(guò)細(xì)胞膜表面的mPR。在研究中可見P作用30min內(nèi)CyclinD1蛋白的表達(dá)無(wú)明顯改變，作用30min后CyclinD1蛋白的表達(dá)出現(xiàn)下降，由于細(xì)胞核內(nèi)的p-ERK作用于CyclinD1基因后需要一定的時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程后，CyclinD1的蛋白含量才發(fā)生變化，所以CyclinD1蛋白改變的時(shí)間落后于p-ERK蛋白。CyclinD1作為ERK的下游蛋白發(fā)揮作用已在許多研究中被證實(shí)，我們推測(cè)在I

14、shikawa細(xì)胞中，P也可能作用于ERK/CyclinD1通路，將其抑制作用迅速傳導(dǎo)至細(xì)胞核，發(fā)揮快速的非基因作用，此點(diǎn)還需在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。P主要作用于活化狀態(tài)的p-ERK，對(duì)總ERK蛋白的表達(dá)無(wú)任何影響。 RU486是一種人工合成的gPR拮抗劑，在本研究中，同時(shí)用P和RU486干預(yù)Ishikawa細(xì)胞，P的抑制作用不被RU486阻止，進(jìn)一步說(shuō)明P的作用不是通過(guò)gPR，在Ishikawa細(xì)胞表面存在著mPR，而P也正

15、是通過(guò)mPR在Ishikawa細(xì)胞中發(fā)揮非經(jīng)典的非基因作用。 本研究中顯示P作用30min后p-ERK和CyclinD1蛋白水平又逐漸升高，在作用120min后達(dá)到最高，這種作用的機(jī)制尚不明確，但國(guó)外有報(bào)導(dǎo)P與gPR結(jié)合后可通過(guò)傳統(tǒng)的基因作用激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使p-ERK蛋白表達(dá)增加，可能在Ishikawa細(xì)胞中P也可以與gPR結(jié)合產(chǎn)生這種作用，當(dāng)快速的非基因作用結(jié)束后，P又通過(guò)此作用將p-ERK和CyclinD1蛋白激