miR-183在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)及其對p535蛋白的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜癌(EndometrialCarcinoma)是女性生殖系統(tǒng)常見腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20％-30％。近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率在全球呈上升趨勢，并且發(fā)病年齡也逐漸年輕化，嚴(yán)重影響著廣大女性的健康和生命。對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的探討一直都是廣大學(xué)者們的研究熱點，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤關(guān)系密切的p53基因可能是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的重要基因，正常p53基因的缺失或突變可導(dǎo)致細(xì)胞的無限生長

2、，并認(rèn)為p53基因的突變是腫瘤發(fā)生的一個早期事件，目前研究發(fā)現(xiàn)在人類惡性腫瘤中至少有50％發(fā)生了p53基因的變化，而在幾乎所有的人類腫瘤中均存在p53信號通路的異常[1]。在已證實多種腫瘤中存在p53蛋白異常表達(dá)研究的基礎(chǔ)上，Berchuka等[2]人的研究發(fā)現(xiàn)在正常子宮內(nèi)膜及不典型增生的子宮內(nèi)膜組織中沒有p53蛋白的表達(dá)，同時在他們的研究中也證實p53蛋白的表達(dá)可以間接反應(yīng)p53基因的突變。大量研究雖已證實p53蛋白與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展

3、與預(yù)后密切相關(guān)，但其在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制及影響其在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的原因仍不明了。近年來在分子生物學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)miRNAs參與了TP53（編碼p53蛋白）的信號傳導(dǎo)通路，并認(rèn)為它們之間存在著錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，miR-183家族是定位于7號染色體，包括miR-183、miR-182、miR-96三種miRNAs，在婦科腫瘤及其他多種腫瘤中存在異常表達(dá)，它們通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞分裂與凋亡的相關(guān)基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Ishikawa細(xì)胞

4、株是一種分化良好、ER受體陽性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，本實驗旨在探討子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中miR-183的表達(dá)狀況及其對p53蛋白表達(dá)和細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為探討子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和臨床診斷、判斷預(yù)后提供新的研究方向和理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株。
　　 2、分組:(1)采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，實驗組轉(zhuǎn)染miR-183的

5、特異性抑制劑反義寡核苷酸;(2)陰性對照組轉(zhuǎn)染無關(guān)miR-183的特異性抑制劑核苷酸序列;(3)脂質(zhì)體對照組轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑;(4)空白對照組不轉(zhuǎn)染。
　　 3、CCK-8法檢測各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖情況。
　　 4、流式細(xì)胞學(xué)方法檢測各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡情況。
　　 5、實時RT-PCR檢測各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中miR-18

6、3和p53mRNA的表達(dá)水平。
　　 6、Westernblot檢測各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)。
　　 7、統(tǒng)計方法:用spss13.0統(tǒng)計軟件，檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗，正態(tài)、方差齊的多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為具有顯著性，所有實驗均重復(fù)3次。
　　 結(jié)果:
　　 1、CCK-8實驗:0-24小時，實驗組、空白對照組、

7、脂質(zhì)體對照組增速相似，陰性對照組略快;24-48小時實驗組、空白對照組和脂質(zhì)體對照組增速較快;48-72小時，轉(zhuǎn)染48小時后，實驗組細(xì)胞較其它各組細(xì)胞增長速度較快;72-96小時，四組細(xì)胞繼續(xù)保持增長狀態(tài)，且達(dá)到對數(shù)生長期，實驗組細(xì)胞較其它各組細(xì)胞增長速度較快。
　　 2、FITC/PI雙染流式細(xì)胞學(xué)法:細(xì)胞轉(zhuǎn)染3天后，實驗組較其他各組早期凋亡率降低明顯，與各組間比較有顯著性差異(P＜0.05);陰性對照組較其他各組早期凋亡率增

8、高明顯，與各組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 3、實時RT-PCR:實驗組miR-183的表達(dá)量相對于各對照組明顯降低，與各組間比較有顯著性差異(P＜0.05);相對于空白對照組與脂質(zhì)體對照組，實驗組與陰性對照組p53mRNA的表達(dá)量明顯降低，有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 4、Westernblot:實驗組p53蛋白表達(dá)明顯高于陰性、空白及脂質(zhì)體對照組，與各組間比較有顯著性差異(P＜0.05）。

9、>　　 結(jié)論:
　　 1、miR-183在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中有表達(dá)，且miR-183抑制劑能有效抑制miR-183在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2、p53蛋白在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中呈高表達(dá)，高表達(dá)的p53蛋白能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞的凋亡。
　　 3、miR-183在轉(zhuǎn)錄后水平抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)。
　　 4、在子宮內(nèi)膜癌I