抑癌基因LKB1調控細胞周期分子機制研究.pdf

1、背景和目的：惡性腫瘤是一類漸進性細胞周期調控機制破壞的疾病，表現(xiàn)為細胞周期失調、信號傳導途徑異常。生物進化過程中，細胞建立了一系列的調控機制，以確保細胞周期各時相嚴格有序地進行。不受控制的細胞增殖是惡性腫瘤的最重要特征；多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均與細胞周期調控功能紊亂有關。因此，對細胞周期調控機制和腫瘤細胞周期調控改變的深入研究，不僅有助于認識腫瘤發(fā)生和演進，還將為腫瘤治療開辟嶄新的思路。
　　 LKB1（Livet Kinas

2、e B1）基因是腫瘤易患綜合征-PJ綜合征（Peutz-Jeghers syndrome，PJS）的致病基因，在高達90％的PJS病人中可檢測到LKB1基因的胚系突變。LKB1基因的功能異常還與全身多種散發(fā)性腫瘤的發(fā)生密切相關，如在30-40％的非小細胞肺癌、20％宮頸癌、19％鱗狀細胞癌以及13％乳腺侵潤性導管癌中均有LKB1基因的失活。LKB1基因在惡性腫瘤發(fā)生中起著重要作用，研究證實LKB1能夠使細胞周期停滯在G1期，抑制細胞生長

3、，但其機理尚不清楚。
　　 本課題通過構建靶向LKB1基因的siRNA質粒、LKB1基因野生型表達質粒和LKB1基因無激酶活性的突變型表達質粒，將重組質粒轉染人正常細胞株和癌細胞株，觀察LKB1的蛋白表達和激酶活性對細胞周期的影響，分析其中重要分子的表達和活性變化，以建立抑癌基因LKB1調控細胞周期的信號通路模型，揭示LKB1抑制細胞惡性增殖的分子背景。
　　 方法：（1）構建靶向LKBl基因的3個siRNA表達質粒，脂

4、質體介導轉染HEK293T和HUVEC細胞，免疫組化、western blot驗證siRNA質粒對LKB1表達的沉默效果，流式細胞術研究HEK293T和HUVEC細胞LKB1表達沉默后細胞周期的變化，western blot檢測細胞周期主要的調控組分Rb、磷酸化Rb、cyclin D1、cyclin E、p53、p21和p16的蛋白水平。
　　 （2）將LKB1基因野生型表達質粒轉染不表達LKB1的Hela細胞，通過G418抗性

5、篩選獲得穩(wěn)定轉染LKB1基因的Hela細胞系，流式細胞術研究LKB1蛋白穩(wěn)定表達對Hela細胞細胞周期的影響，western blot檢測磷酸化Rb、PCNA、AMPKot及磷酸化AMPKα的蛋白水平，分析AMPK抑制劑Compound C對PCNA表達的影響。
　　 （3）通過體外定點突變技術，將LKB1蛋白激酶催化域第78位賴氨酸的編碼堿基突變?yōu)榧琢虬彼岬木幋a堿基，構建無激酶活性的突變型LKB1基因表達質粒，將LKB1基因野

6、生型質粒和突變型質粒轉染HEK293T細胞后，流式細胞術研究細胞周期的變化，western blot檢測磷酸化Rb、PCNA、AMPKα及磷酸化AMPKα的蛋白水平。
　　 結果：（1）成功構建靶向LKB1基因的3個siRNA表達質粒，轉染HEK293T和HUVEC細胞后，3個干擾質粒均能有效沉默LKB1蛋白表達，其中干擾質粒pshRNA-1和pshRNA-3效果尤為明顯（抑制率>70％）。HEK293T和HUVEC細胞內源性L

7、KB1表達沉默后，細胞G1期比例明顯下降，S期比例增加，Rb蛋白的磷酸化水平顯著增強，p53和p16表達顯著減弱，而總Rb蛋白、wclin D1、cyclin E表達水平無明顯變化。
　　 （2）成功構建穩(wěn)定轉染LKB1基因的Hela細胞系LXB1蛋白穩(wěn)定表達的Hela細胞G1期比例明顯增加，S期比例減少，Rb蛋白的磷酸化水平、PCNA表達水平明顯降低，AMPKα的磷酸化水平明顯增強，當用Compound C抑制Hela穩(wěn)定株細

8、胞AMPK活性后，PCNA蛋白表達水平明顯提高。
　　 （3）成功構建無激酶活性的突變型LXB1基因表達質粒，與空質粒轉染組細胞相比，轉染LKB1野生型質粒的HEK293T細胞G1期比例明顯增加，S期比例減少，Rb蛋白的磷酸化水平、PCNA表達水平明顯降低，AMPKa的磷酸化水平明顯增強，而LKB1突變型質粒轉染細胞后無明顯變化。
　　 結論：（1）在HEK293T和HUVEC細胞中沉默內源性LKB1表達通過下調p53和