LRIG1抑癌基因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用和分子機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的：LRIG1基因是新發(fā)現(xiàn)的與果蠅Kek-1基因結(jié)構(gòu)相似的人類基因組成員。Kek-1基因編碼一種果蠅細(xì)胞表面跨膜蛋白——Kek-1蛋白，它參與果蠅表皮生長因子受體(EGFR)信號(hào)系統(tǒng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。人類LRIG1蛋白是一種跨膜糖蛋白，在腦組織表達(dá)較高。LRIG1與人類腫瘤尤其是與腦組織發(fā)生的腫瘤的關(guān)系還不明確，與人類EGFR的關(guān)系和機(jī)制仍然未知。本研究的目的在于以人腦膠質(zhì)瘤為平臺(tái)，研究LRIG1與人類腫瘤的關(guān)系，探討LRIG1

2、與EGFR的相互作用及其內(nèi)在分子機(jī)制。 方法：首先設(shè)計(jì)、制作LRIG1mRNA寡核苷酸探針，用原位雜交方法檢測(cè)LRIG1mRNA在人星形細(xì)胞瘤組織和腫瘤周邊組織中表達(dá)的差異，分析這種差異與腫瘤級(jí)別的關(guān)系(第一部分)；然后原代培養(yǎng)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞，觀察LRIG1表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及對(duì)表皮生長因子(EGF)促腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響(第二部分)；接著利用PCR技術(shù)和基因重組技術(shù)，構(gòu)建含LRIG1胞外段+跨膜段(LRIG1-ET)和LRI

3、G1跨膜段+胞內(nèi)段(LRIG1-TC)的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，并分別檢測(cè)它們?cè)谡婧思?xì)胞中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位(第三部分)；最后，將上述兩個(gè)構(gòu)建的質(zhì)粒及含LRIG1全長(LRIG1-FL)的質(zhì)粒(惠贈(zèng))轉(zhuǎn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251或原代星形細(xì)胞瘤細(xì)胞，用放射性受體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合EGF能力的變化，用westernblot檢測(cè)EGFR下游信號(hào)MEK活化的變化，用MTT實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長活性的變化。 結(jié)果：相對(duì)

4、于腫瘤周邊腦組織表達(dá)的LRIG1(91.43±3.77％)，人星形細(xì)胞瘤表達(dá)LRIG1下調(diào)(69.98±15.75％)，下調(diào)的程度與腫瘤級(jí)別相關(guān)；腫瘤組織、培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞表達(dá)的LRIG1均與其表達(dá)的PCNA呈負(fù)相關(guān)，LRIG1表達(dá)高對(duì)EGF的促腫瘤增殖有抑制作用；構(gòu)建的質(zhì)粒序列正確，可在真核細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物均主要位于胞膜、部分位于胞漿；轉(zhuǎn)染含LRIG1ET、TC、FL的質(zhì)粒均使細(xì)胞表面EGF受體解離常數(shù)(KD)增大，最大結(jié)合位點(diǎn)(B

5、max)減少，其中轉(zhuǎn)染LRIG1-ET的細(xì)胞KD增大最明顯(增加135.50％)，轉(zhuǎn)染LRIG1-FL者Bmax減少最明顯(減少40.05％)使細(xì)胞內(nèi)MEK磷酸化程度下降和細(xì)胞生長抑制最明顯的是LRIG1-FL(分別為48.0％和43.2％)，其次為LRIG1-TC(分別為34.3％和35.8％)，LRIG1-ET也能抑制MEK磷酸化和細(xì)胞增殖但其抑制作用最小(分別為13.0％和28.2％)。 結(jié)論：LRIG1符合人類抑癌基因的