LRIG1抑癌基因對人腦膠質瘤細胞的作用和分子機制.pdf

1、研究背景與目的：LRIG1基因是新發(fā)現的與果蠅Kek-1基因結構相似的人類基因組成員。Kek-1基因編碼一種果蠅細胞表面跨膜蛋白——Kek-1蛋白，它參與果蠅表皮生長因子受體(EGFR)信號系統(tǒng)的負反饋調節(jié)。人類LRIG1蛋白是一種跨膜糖蛋白，在腦組織表達較高。LRIG1與人類腫瘤尤其是與腦組織發(fā)生的腫瘤的關系還不明確，與人類EGFR的關系和機制仍然未知。本研究的目的在于以人腦膠質瘤為平臺，研究LRIG1與人類腫瘤的關系，探討LRIG1

2、與EGFR的相互作用及其內在分子機制。 方法：首先設計、制作LRIG1mRNA寡核苷酸探針，用原位雜交方法檢測LRIG1mRNA在人星形細胞瘤組織和腫瘤周邊組織中表達的差異，分析這種差異與腫瘤級別的關系(第一部分)；然后原代培養(yǎng)星形細胞瘤細胞，觀察LRIG1表達對腫瘤細胞增殖及對表皮生長因子(EGF)促腫瘤細胞增殖作用的影響(第二部分)；接著利用PCR技術和基因重組技術，構建含LRIG1胞外段+跨膜段(LRIG1-ET)和LRI

3、G1跨膜段+胞內段(LRIG1-TC)的轉基因質粒，并分別檢測它們在真核細胞中的表達和亞細胞定位(第三部分)；最后，將上述兩個構建的質粒及含LRIG1全長(LRIG1-FL)的質粒(惠贈)轉入膠質瘤細胞系U251或原代星形細胞瘤細胞，用放射性受體結合試驗檢測轉染細胞表皮生長因子受體(EGFR)結合EGF能力的變化，用westernblot檢測EGFR下游信號MEK活化的變化，用MTT實驗觀察轉染后細胞生長活性的變化。 結果：相對

4、于腫瘤周邊腦組織表達的LRIG1(91.43±3.77％)，人星形細胞瘤表達LRIG1下調(69.98±15.75％)，下調的程度與腫瘤級別相關；腫瘤組織、培養(yǎng)的腫瘤細胞表達的LRIG1均與其表達的PCNA呈負相關，LRIG1表達高對EGF的促腫瘤增殖有抑制作用；構建的質粒序列正確，可在真核細胞中表達，表達產物均主要位于胞膜、部分位于胞漿；轉染含LRIG1ET、TC、FL的質粒均使細胞表面EGF受體解離常數(KD)增大，最大結合位點(B

5、max)減少，其中轉染LRIG1-ET的細胞KD增大最明顯(增加135.50％)，轉染LRIG1-FL者Bmax減少最明顯(減少40.05％)使細胞內MEK磷酸化程度下降和細胞生長抑制最明顯的是LRIG1-FL(分別為48.0％和43.2％)，其次為LRIG1-TC(分別為34.3％和35.8％)，LRIG1-ET也能抑制MEK磷酸化和細胞增殖但其抑制作用最小(分別為13.0％和28.2％)。 結論：LRIG1符合人類抑癌基因的