細胞周期的調(diào)控（cellcyclins）

1、CELL CYCLE,第二節(jié)細胞周期的調(diào)控,一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用,1970s Rao和Johnson發(fā)現(xiàn)與M期細胞(Hela)融合的間期細胞染色體發(fā)生凝縮，稱為早熟凝集染色體(prematurely condensed chromosome，PCC)。G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復(fù)制。G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復(fù)制已完成。甚至不同類的M期細胞也可誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，

2、說明M期細胞具有促進間期細胞進行分裂的因子，即成熟促進因子(maturation promoting factor， MPF)。,染色體超前凝集（PCC）,細胞融合與PCC(Premature chromosomal condense),人們猜測，在M期的細胞中存在著某種物質(zhì)，它能夠促進染色體的凝聚和細胞的分裂。后來，人們在不同類型的M期細胞中分別提取出了能夠促進細胞分裂的的因子，統(tǒng)稱為成熟促進因子(maturation promoti

3、ng factor，MPF)。,處于第六期的爪蟾卵母細胞（RD前期I），具GV。,爪蟾卵子成熟過程,MPF的發(fā)現(xiàn)？,注射實驗表明：孕酮誘導(dǎo)卵母細胞成熟；成熟卵細胞質(zhì)中，含有卵母細胞成熟的因子，稱做MPF。,◆MPF是一種使多種底物蛋白磷酸化的蛋白激酶； 主要含有p32和p45兩種蛋白,二、p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系 1960s Leland Hartwell 芽殖酵母 1970s Pa

4、ul Nurse 裂殖酵母 利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細胞分裂有關(guān)的基因(cell division cycle gene, CDC)。如,—裂殖酵母cdc2、 芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無法分裂—wee1突變型則提早分裂，cdc25突變型細胞體積增大而不分裂—cdc2和cdc28都編碼一個34KD的蛋白激酶，促進細胞周期的進行 其產(chǎn)物分別為p34cdc2 （G2/M）、 p34cd

5、c28（G2/S或G2/M） weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進CDC2的活性。,Fission yeast （裂殖酵母）,budding yeast （芽殖酵母）,Cdc 25 & Wee1 mutant,1980s Timothy Hunt發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細胞周期振蕩，命名為周期蛋白(cyclin A和B)。后來發(fā)現(xiàn)各類動物來源的細胞周期蛋白mRNA均能誘導(dǎo)蛙卵的成熟。1988年Lohka

6、將非洲爪蟾的MPF純化。經(jīng)鑒定MPF由32KD和45KD兩種蛋白組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。進一步的研究發(fā)現(xiàn)MPF=Cdc2+clyclin B,1988年M. J. Lohka 純化了爪蟾的MPF，經(jīng)鑒定由32KD和45KD兩種蛋白組成，二者結(jié)合可使多種蛋白質(zhì)磷酸化。,MPF、Cdc和Cyclin的關(guān)系,MPF的生化成分：含有兩個亞單位MPF =Cdc2+cyclin （催化亞單位+調(diào)節(jié)亞單位）,后來Paul Nurse（19

7、90）進一步的實驗證明P32實際上是Cdc2的同源物，而P45是cyclinB的同源物，從而將細胞周期三個領(lǐng)域的研究聯(lián)系在一起。即MPF是由cyclin和CDC基因編碼的依賴于cyclin的蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)，,Leland H. Hartwell,R. Timothy (Tim) Hunt,Sir Paul M. Nurse,2001年10月8日美國人Leland Hartw

8、ell、英國人Paul Nurse、Timothy Hunt因?qū)毎芷谡{(diào)控機理的研究而獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。,三、細胞周期蛋白cyclin,特點：在細胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框（cyclin box），介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。（M期周期蛋白N端：破壞框；G1期周期蛋白：C端含PEST序列）作用：激活CDK，引導(dǎo)CDK作用于不同底物。已知30余種，在脊椎動物中為A1-2、B1-

9、3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。,Destruction Box in Cyclins,不同類型的CDK/cyclin復(fù)合體,*包括D1-3，各亞型cyclin D在不同細胞中的表達量不同，但具有相同的功效。,◆活化 ·隨Cyclin濃度變化而變化 ·激酶與磷酸酶的調(diào)節(jié)， 活化的MPF可使更多的MPF活化 ◆功能：啟動細胞從G2期進

10、入M期的相關(guān)事件,周期蛋白,,,,CDK1的調(diào)節(jié)與活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase,,,,,,Cdc2與細胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。Cdc2又被稱為CDK1，可將特定蛋白磷酸化，促進細胞周期運行，又稱作細胞周期引擎。如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等。在動物中已知7

11、種CDK。均含有一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。,四、CDK激酶和CDK激酶抑制劑,控制細胞周期的蛋白質(zhì),CDK類蛋白激酶：這類蛋白激酶常以磷酸化的形式直接作用于細胞周期，包括DNA合成的啟動和終止，染色體的凝集、運動和松懈，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纖層的降解和重新聚合，紡綞體的形成和消失等。它們可根據(jù)作用的時期不同分為G1、G1/S、S期CDK，及M期CDK。cyclin：

12、是一類能與CDK結(jié)合，使CDK磷酸化和活化的蛋白。這類蛋白的活性是隨細胞周期而進行周期性的變化。,CDK抑制因子（CDK inhibitor，CKI） 細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子對細胞周期起負調(diào)控作用，目前發(fā)現(xiàn)的CKI分為兩大家族：①Ink4(Inhibitor of cdk 4)，如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特異性抑制cdk4·cyclin D1、cdk6&#

13、183;cyclin D1復(fù)合物。②Kip(Kinase inhibition protein)：包括P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等，能抑制大多數(shù)CDK的激酶活性，P21cip1還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）結(jié)合，直接抑制

14、DNA的合成,五、細胞周期運轉(zhuǎn)調(diào)控制,一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的關(guān)鍵性調(diào)控作用二）M期周期蛋白與分裂中期向分裂后期轉(zhuǎn)化三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDK激酶,CDK激酶對cell cycle起核心性的調(diào)控作用，不同的cyclin結(jié)合不同的CDK，構(gòu)成不同的CDK激酶不同的CDK激酶在cell cycle不同時期表現(xiàn)出活性，對細胞周期進行不同的調(diào)節(jié)。,G1期，在生長因子的刺激下，cyclin D表達，并與C

15、DK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。,1、G1期時MFP的激活,2、在G1-S期 cyclinE與CDK2結(jié)合，促進細胞通過G1/S限制點而進入S期。向細胞內(nèi)注射Cyclin E的抗體能使細胞停滯于G1期，說明細胞進入S期需要CyclinE的參與。同樣將CyclinA的抗體注射到細胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能抑制細胞的DNA合成，推測Cyc

16、linA是DNA復(fù)制所必需的,3、在G2-M期 cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細胞周期事件,cell cycle regulation,,在中期當MPF活性達到最高時，通過一種未知的途徑，激活后期蛋白復(fù)合體-APC，將遍在蛋白連接在cyclinB上，導(dǎo)致cyclinB被蛋白酶體（proteasome）降解，完成一個細胞周

17、期,分裂期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱破壞框(destruction box)。泛素由76個氨基酸組成，高度保守。共價結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別和降解，這是細胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。26S蛋白酶體是一個大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。,Destruction Box in Cyclins,Anaphase Promoting Complex (APC), 調(diào)控紡錘體裝配檢驗點,

18、·APC介導(dǎo)選擇性降解的靶蛋白與Ubiquitin結(jié)合 (通過泛素依賴性途徑降解) ·APC主要介導(dǎo)兩類蛋白降解: Anaphase Inhibitors和Mitotic Cyclin. 前者維持姐妹染色單體粘連, 抑制后期啟動；后者的降解意味著有絲分裂即將結(jié)束，即染色體開始去凝集，核膜重建。· Cdc20 和Mad2蛋白位于動粒上，在染色體結(jié)合有絲分裂紡錘體前將不能從動粒上釋放，由于Mad2與C

19、dc20結(jié)合而抑制APC的活性。所以只有所有染色體都與紡錘體結(jié)合后，APC才有活性，才啟動細胞向后期轉(zhuǎn)換。,,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。結(jié)合cyclin B的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDK activati

20、ng kinase CAK)的作用下完成的。,M期CDK的激活,CDK activating,,DNA的復(fù)制是由起始復(fù)制點（origins of replication）開始的，起始復(fù)制點是一種自主復(fù)制序列，散布在染色體上。在整個細胞周期中，起始復(fù)制點上結(jié)合有復(fù)制起始點識別復(fù)合體（Origin recognition complex, Orc），其作用就象一個停泊點，供其它調(diào)節(jié)因子?？?。Cdc6是其中的一個調(diào)節(jié)因子，在G1期CDC6含

21、量瞬間提高，Cdc6結(jié)合在Orc上，在ATP供能下，促進6個亞單位構(gòu)成的MCM復(fù)合體和其他一些蛋白結(jié)合到ORC上，形成前復(fù)制復(fù)合體（pre-replicative complex，pre-RC）DNA復(fù)制執(zhí)照因子學(xué)說；MCM實際上就是DNA解旋酶。,DNA復(fù)制的控制,S-CDK觸發(fā)pre-RC的啟動，同時阻止了DNA再次進行復(fù)制，因為S-CDK將CDC6磷酸化，使其脫離ORC，磷酸化的CDC6隨后被SCF參與的遍在蛋白化途徑降解。從而

22、保證了DNA的復(fù)制當且僅當一次,限制點在細胞周期中的作用,細胞要分裂，必須正確復(fù)制DNA和達到一定的體積，在獲得足夠物質(zhì)支持分裂以前，細胞不可能進行分裂。細胞周期的運行，是在一系列稱為檢驗點（check point）的嚴格檢控下進行的，當DNA發(fā)生損傷，復(fù)制不完全或紡錘體形成不正常，周期將被阻斷。,細胞周期的限制點有四個： G1/S檢驗點:在酵母中稱start點，在哺乳動物中稱R點(restriction point)，控制細胞由靜

23、止狀態(tài)的G1進入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細胞外環(huán)境是否適宜？細胞體積是否足夠大？ S期檢驗點：DNA復(fù)制是否完成？ G2/M檢驗點：是決定細胞一分為二的控制點，相關(guān)的事件包括：DNA是否損傷？細胞體積是否足夠大？ 中-后期檢驗點（紡錘體組裝檢驗點）：任何一個著絲點沒有正確連接到紡錘體上，都會抑制APC的活性，引起細胞周期中斷。,Four checkpoints,,ATM（ataxia telangiect

24、asia-mutated gene）。最早發(fā)現(xiàn)于毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥患者，人類中大約有1%的人是ATM缺失的雜合子，表現(xiàn)出對電離輻射敏感和易患癌癥。ATM編碼一個蛋白激酶，結(jié)合在損傷的DNA上，其信號通路有兩條。①激活Chk1（checkpoint kinase）, 使CDC25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中斷細胞周期。②激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作為轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致P21的表達，

25、P21抑制G1-S期CDK的活性，中斷細胞周期。,,癌基因和抑癌基因——主要的內(nèi)在因素’外在因素：離子輻射、化學(xué)物質(zhì)作用、病毒感染、溫度變化、PH變化等,六、其他內(nèi)在和外在因素在細胞周期調(diào)控中的作用,七、生長因子對細胞增殖的影響,單細胞生物的增殖取決于營養(yǎng)，多細胞生物細胞的增殖與信號途徑有關(guān)。生長因子：是與細胞增殖有關(guān)的信號物質(zhì)，已知幾十種，多數(shù)能促進細胞增殖，又稱有絲分裂原（mitogen），如EGF、NGF。作用方式：旁分泌