MEN1基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、奶牛的產(chǎn)奶量主要取決于乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量及其分泌活性，增加乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量對提高產(chǎn)奶量具有重要意義。MEN1編碼menin蛋白，在細(xì)胞增殖分裂、細(xì)胞周期調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因組穩(wěn)定等過程中發(fā)揮重要作用。MEN1基因是多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤1型綜合征的關(guān)鍵致病基因之一，對于特定組織中細(xì)胞的異常增殖起到了誘發(fā)的作用。另一方面，MEN1對于機(jī)體的正常代謝起著重要的調(diào)控作用。乳腺是一個(gè)重要的代謝器官。本研究擬探討menin在奶牛的乳腺組織及其乳腺上

2、皮細(xì)胞中的功能。研究發(fā)現(xiàn)不同生理階段的奶牛乳腺組織中MEN1/menin表達(dá)存在表達(dá)變化，進(jìn)而通過過表達(dá)/RNAi干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中MEN1/menin表達(dá)變化可以改變細(xì)胞的生長和增殖。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用RT-PCR、WB、免疫組化方法分別檢測不同泌乳階段的奶牛乳腺組織MEN1/Menin的表達(dá)變化。menin蛋白陽性點(diǎn)主要位于乳腺腺泡及乳腺導(dǎo)管的上皮細(xì)胞中，不同生理階段的奶牛乳腺組織中MEN1 mRN

3、A水平存在表達(dá)變化，menin蛋白各組之間無差異。
　　2.成功建立了真核細(xì)胞奶牛Menin蛋白過表達(dá)轉(zhuǎn)染體系。利用基因重組技術(shù)，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Myc-His-bmen1;將重組載體分別轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)，分別在24h、48h、72h檢測目的基因/蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明在3種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染24h后過表達(dá)效果最好，在MAC-T、CHO、C2C

4、12細(xì)胞中menin過表達(dá)效率分別達(dá)到4.41、5.65、1.93倍。
　　3.將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MAC-T細(xì)胞，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組MEN1基因表達(dá)顯著升高（P＜0.01），在轉(zhuǎn)染后24h表達(dá)量最高，轉(zhuǎn)染組是對照組的27.5倍，menin蛋白的過表達(dá)倍數(shù)為4.41倍。
　　4.成功建立了真核細(xì)胞奶牛Menin蛋白限量表達(dá)體系。將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)MAC-T細(xì)胞中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染sibMEN-1/2/324h后，MEN1基因在mRNA

5、和蛋白表達(dá)水平相比對照組均最低并達(dá)到極顯著(P＜0.01)，干擾效率分別為75％、71％。
　　5.在過量/限量表達(dá)menin的條件下，利用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和qRT-PCR技術(shù)，從不同角度都證明menin可以調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞周期。menin過表達(dá)對細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期沒有顯著影響;menin限量表達(dá)能顯著提高G1期細(xì)胞百分比，降低S期百分比(P＜0.05)，CyclinD3、CyclinB2、CDK6基因的表