MEN1基因對奶牛乳腺上皮細胞細胞周期調控機制的研究.pdf

1、奶牛的產奶量主要取決于乳腺上皮細胞的數量及其分泌活性，增加乳腺上皮細胞的數量對提高產奶量具有重要意義。MEN1編碼menin蛋白，在細胞增殖分裂、細胞周期調控以及轉錄調節(jié)、基因組穩(wěn)定等過程中發(fā)揮重要作用。MEN1基因是多發(fā)性內分泌腫瘤1型綜合征的關鍵致病基因之一，對于特定組織中細胞的異常增殖起到了誘發(fā)的作用。另一方面，MEN1對于機體的正常代謝起著重要的調控作用。乳腺是一個重要的代謝器官。本研究擬探討menin在奶牛的乳腺組織及其乳腺上

2、皮細胞中的功能。研究發(fā)現不同生理階段的奶牛乳腺組織中MEN1/menin表達存在表達變化，進而通過過表達/RNAi干擾技術，發(fā)現奶牛乳腺上皮細胞中MEN1/menin表達變化可以改變細胞的生長和增殖。主要研究結果如下:
　　1.利用RT-PCR、WB、免疫組化方法分別檢測不同泌乳階段的奶牛乳腺組織MEN1/Menin的表達變化。menin蛋白陽性點主要位于乳腺腺泡及乳腺導管的上皮細胞中，不同生理階段的奶牛乳腺組織中MEN1 mRN

3、A水平存在表達變化，menin蛋白各組之間無差異。
　　2.成功建立了真核細胞奶牛Menin蛋白過表達轉染體系。利用基因重組技術，成功構建了真核表達載體pcDNA3.1-Myc-His-bmen1;將重組載體分別轉染奶牛乳腺上皮細胞(MAC-T)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、小鼠成肌細胞(C2C12)，分別在24h、48h、72h檢測目的基因/蛋白的表達，結果表明在3種細胞中轉染24h后過表達效果最好，在MAC-T、CHO、C2C

4、12細胞中menin過表達效率分別達到4.41、5.65、1.93倍。
　　3.將真核表達載體轉染MAC-T細胞，結果表明轉染組MEN1基因表達顯著升高（P＜0.01），在轉染后24h表達量最高，轉染組是對照組的27.5倍，menin蛋白的過表達倍數為4.41倍。
　　4.成功建立了真核細胞奶牛Menin蛋白限量表達體系。將siRNA轉染進MAC-T細胞中，結果表明轉染sibMEN-1/2/324h后，MEN1基因在mRNA

5、和蛋白表達水平相比對照組均最低并達到極顯著(P＜0.01)，干擾效率分別為75％、71％。
　　5.在過量/限量表達menin的條件下，利用CCK-8、流式細胞術和qRT-PCR技術，從不同角度都證明menin可以調控奶牛乳腺上皮細胞的增殖以及細胞周期。menin過表達對細胞增殖及細胞周期沒有顯著影響;menin限量表達能顯著提高G1期細胞百分比，降低S期百分比(P＜0.05)，CyclinD3、CyclinB2、CDK6基因的表