巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶-8在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻后腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá).pdf

1、目的：檢測(cè)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶-8（fucosyltransferase-8，F(xiàn)UT8）在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）腎組織中的表達(dá)，探討其與腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）的時(shí)空關(guān)系。 方法：（1）實(shí)驗(yàn)分組清潔級(jí)雌性Wistar大鼠90只，6～8周齡，隨機(jī)分為3組：正常組（CON組，n=30）、單側(cè)輸尿管梗阻組（UUO組，n

2、=30）、假手術(shù)組（SOR組，n=30）。UUO組為打開(kāi)腹腔游離左側(cè)輸尿管上段，在近腎盂處結(jié)扎輸尿管；SOR組為打開(kāi)腹腔，游離左側(cè)輸尿管近腎盂端，但不結(jié)扎輸尿管。其中UUO組隨機(jī)分別在手術(shù)后的1d、3d、7d、14d、21d放血法處死，標(biāo)記為UUO1d、UUO3d、UUO7d、UUO14d、UUO21d；處死時(shí)下腔靜脈采血5ml，分離上清保存于-20℃，檢測(cè)血肌酐（serum creatinin，Scr）和尿素氮（blood urea

3、nitrogen，BUN）。取左腎，小心剝?nèi)ツI包膜后，置于滴有生理鹽水的平皿上，一部分新鮮腎組織做冰凍切片間接免疫熒光，另取一部分10%甲醛固定，剩余腎皮質(zhì)凍存于-80℃用于RT-PCR和Western blot分析。（2）腎組織石蠟切片行PAS、Masson染色，光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織病理改變。（3）免疫熒光新鮮腎組織冰凍切片，胎牛血清封閉，依次滴加一抗、熒光標(biāo)記二抗，最后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織不同時(shí)間點(diǎn)FUT8

4、、ALK5的分布以及表達(dá)。（4）RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腎組織不同時(shí)間點(diǎn)FUT8 mRNA的表達(dá)。（5）Western blot檢測(cè)各組大鼠腎組織不同時(shí)間點(diǎn)FUT8在蛋白水平的表達(dá)。（6）免疫組化檢測(cè)大鼠腎臟纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、Ⅰ型膠原、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)。 結(jié)果：（1）腎組織病理改變：與CON組和SOR組比較，UUO組腎臟呈進(jìn)行性間質(zhì)纖維

5、化改變，包括腎小管細(xì)胞空泡樣變性，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而腎小管萎縮、擴(kuò)張，腎間質(zhì)纖維化等。UUO手術(shù)后3d可見(jiàn)小管間質(zhì)內(nèi)有散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分小管空泡變性；術(shù)后7d出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)萎縮腎小管；14d腎臟間質(zhì)明顯纖維化；21d上述改變更加明顯，腎小管基底膜增厚萎縮；在觀察時(shí)間內(nèi)均未見(jiàn)明顯腎小球硬化。（2）CON組和SOR組大鼠血清Scr、BUN無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；UUO組Scr、BUN在UUO7d、UUO14d、UUO2

6、1d時(shí)高于CON組和SOR組（P<0.05）。（3）間接免疫熒光結(jié)果：CON組和SOR組大鼠腎組織，F(xiàn)UT8主要在腎小管有較低的表達(dá)（+），腎小球僅偶有極微量（±）表達(dá)，兩組FUT8的表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在UUO組的大鼠腎組織中，在腎小球未觀察到FUT8的陽(yáng)性表達(dá)，術(shù)后3d FUT8在腎小管表達(dá)明顯增強(qiáng)，在14d時(shí)達(dá)到高峰，21d表達(dá)下降，其中UUO7d、UUO14d、UUO21d與CON組和SOR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、（P<0.05）。ALK5在腎小管的表達(dá)與FUT8一致，在手術(shù)后3d逐漸增加，14d達(dá)到高峰，隨后21d下降，二者呈正相關(guān)（r=0.87，P<0.05）。FUT8與ALK5熒光共染發(fā)現(xiàn)兩者在腎小管的分布一致，且兩者共表達(dá)區(qū)域隨著腎纖維化進(jìn)展逐漸增加。（4）RT-PCR檢測(cè)FUT8在基因水平的表達(dá)：CON組FUT8mRNA微量表達(dá)；SOR組在手術(shù)后1d較CON組略微有所增高，但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在UUO手術(shù)后3d

8、FUT8 mRNA的表達(dá)較CON組和SOR組顯著增加，在14d達(dá)到高峰，21d下降：UUO7d、UUO14d、UUO21d FUT8 mRNA的表達(dá)與CON組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（5）Western blot檢測(cè)FUT8在蛋白水平的表達(dá)：CON組和SOR組FUT8在蛋白水平都有微量表達(dá)，SOR組表達(dá)高于CON組，但兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）； UUO組與兩組比較FUT8蛋白表達(dá)均增加且呈逐漸上升趨勢(shì)，在14d達(dá)到

9、高峰，21d下降，但都較CON組顯著增加；其中UUO7d、UUO14d、UUO21d組與CON組、SOR組比較FUT8蛋白表達(dá)有顯著差異（P<0.05）。（6）免疫組化顯示：UUO組大鼠梗阻側(cè)腎組織FN、Ⅰ型膠原、α-SMA陽(yáng)性染色面積隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，其中UUO7d、UUO14d、UUO21d與CON組和SOR組比較有顯著差異（P<0.05）。FN、Ⅰ型膠原、α-SMA的表達(dá)與FUT8呈正相關(guān)（r分別為0.80，0.76，0.8