結直腸鋸齒狀病變RUNX3基因甲基化及蛋白表達的意義;結直腸SSA-P和TSA的臨床病理學及免疫組化研究.pdf

1、實驗一，結直腸鋸齒狀病變RUNX3基因甲基化及蛋白表達的意義
　　[背景與目的]：
　　結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是我國常見的嚴重威脅人類健康惡性腫瘤。鋸齒狀病變具有惡變?yōu)镃RC的潛能,近年來受到廣泛關注。WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤新分類把鋸齒狀病變定義為：一組以上皮呈鋸齒狀結構為特征的病變,包括：①增生性息肉(hyperplastic polyp,HP),根據(jù)黏液類型又分為微小泡型(mic

2、rovesicula HP,MVHP)、杯狀細胞型(goblet cell rich HP,GCHP)和黏液缺乏型(mucin poor HP,MPHP)；②廣基鋸齒狀息肉/腺瘤(sessile serrated adenoma/polyp, SSA/P),③傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)；④鋸齒狀腺癌(serrated adenocarcinoma, SAC)。這些病變是1個連續(xù)的譜

3、系,有明顯的異質性,具有特殊的分子改變,呈現(xiàn)出1 條與經(jīng)典“腺瘤-癌”并存的新的致癌途徑,即鋸齒狀通路。據(jù)最新報告,60％的CRC 來自普通腺瘤,35%來自鋸齒狀通路,尤其是來自CpG島甲基化表型(CpG island methlylator phenohype,CIMP)的鋸齒狀病變。鋸齒狀通路是一個多因素、多階段、多基因改變的錯綜復雜的漸進性累積過程。在此演變過程中涉及多種癌和抑癌基因的表觀遺傳學改變,這些基因的異常改變導致了鋸齒狀

4、病變特殊結構的生成和惡變生成CRC。DNA甲基化是表觀遺傳學的一種主要調控機制,異常甲基化將引起抑癌基因表達下調甚至沉默,進而導致腫瘤的發(fā)生。
　　RUNX3(runt-related transcription factor 3)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因,定位于人類染色體1號短臂1p36.1,RUNX3蛋白在TGF-β信號通路中發(fā)揮著重要的作用。RUNX3基因表達下調或沉默在人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用,而啟動子

5、區(qū)CpG島高甲基化是RUNX3基因失活的主要發(fā)生機制。研究發(fā)現(xiàn), RUNX3基因指導TGF-β信號轉導過程而抑制細胞增生并促進凋亡,在CRC的發(fā)病機制中扮演重要角色,但RUNX3基因在鋸齒狀通路中作用尚不明確。目前國內、外有關RUNX3在鋸齒狀病變中作用的研究報告很少,更沒有相關表觀遺傳學方面的研究。本研究通過Taqman 探針為基礎的實時熒光定量PCR (Real-time quantitative Polymerase Chain

6、Reaction,RT-PCR)法來分析鋸齒狀病變中RUNX3基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài),并觀察相應組織中RUNX3蛋白的表達情況,通過分析兩者的關系,從而對RUNX3基因在鋸齒狀病變及鋸齒狀癌變通路中的作用進行初步探討。
　　[方法]：
　　收集2007-2012年間北京軍區(qū)總醫(yī)院病理診斷為鋸齒狀病變291例,進行回顧性閱片。所有切片按WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤分類標準,由3名病理醫(yī)師4～5輪閱片,從中篩選出77例

7、鋸齒狀病變(29例HP、29例SSA/P和19例TSA)作為實驗組,并收集16例正常結直腸組織和14例CRC作為對照組。應用TaqMan探針為基礎的RT-PCR技術檢測29例HP、29例SSA/P、19例TSA、14例CRC和16例正常結直腸組織中RUNX3基因CpG島甲基化狀態(tài)。同時相應的組織均切片進行免疫組化染色,觀察RUNX3蛋白的表達情況;并分析RUNX3基因甲基化與RUNX3蛋白的表達結果之間的關系。
　　[結果]：

8、r>　　1.對RUNX3基因啟動子CpG島甲基化在正常組、HP組、SSA/P組、TSA組以及CRC組的狀態(tài)進行統(tǒng)計學分析,結果顯示:正常組織中未檢測到RUNX3基因CpG島甲基化;SSA/P、TSA、CRC三組甲基化率比正常和HP組明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義,(P<0.05);但HP與正常組之間,SSA/P、TSA、CRC三組之間差異均不顯著(P>0.05)。2.對RUNX3在正常組、HP組、SSA/P組、TSA組以及CRC組的免疫組

9、織化學表達進行統(tǒng)計學分析,結果顯示:RUNX3在SSA/P、TSA、CRC三組陽性率比正常組明顯降低,且SSA/P、TSA、CRC三組分別與正常組之間有顯著性差異(P<0.05);TSA、CRC兩組分別與HP組之間有顯著性差異(P<0.05);SSA/P與CRC之間有顯著性差異(P<0.05);但HP分別與正常、SSA/P組,SSA/P與TSA組之間差異均不顯著(P>0.05)。3.RUNX3甲基化與RUNX3蛋白表達相關性分析:SSA

10、/P、TSA和CRC三組中RUNX3甲基化與RUNX3蛋白表達結果具有相關性(P<0.05),并且為負相關;而正常結直腸黏膜組織和HP中RUNX3甲基化與RUNX3蛋白表達結果相關性不顯著(P>0.05)。
　　[結論]：
　　1.免疫組化染色結果顯示:RUNX3在正常腸組織、鋸齒狀病變、CRC中陽性表達率呈遞減趨勢,尤其是在SSA/P、TSA和CRC中陽性率明顯降低;提示RUNX3蛋白表達減少或缺失可能是鋸齒狀病變發(fā)生和惡

11、變通路中的必要條件。
　　2.TaqMan探針RT-PCR結果顯示:SSA/P、TSA、CRC三組甲基化率比正常和HP組明顯增高,差異顯著,(P<0.05);甲基化陽性率隨病變嚴重程度呈增加趨勢。RUNX3基因啟動子CpG島甲基化在鋸齒狀病變及CRC的發(fā)病機制中扮演重要角色。
　　3.RUNX3基因啟動子區(qū)域甲基化可能誘導RUNX3蛋白表達減少或缺失,提示其可促進鋸齒狀病變尤其是鋸齒狀腺瘤及癌變通路的發(fā)生,進而惡變?yōu)镃RC。

12、
　　實驗二，結直腸SSA/P和TSA的臨床病理學及免疫組化研究
　　[背景與目的]：
　　近年來,結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是我國發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一 ,研究表明,CRC發(fā)病率持續(xù)增加的主要原因就是缺乏對鋸齒狀病變的正確認識。鋸齒狀病變的形態(tài)學、生物學行為及分子遺傳學改變均不同于普通息肉和腺瘤。WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤新分類中把鋸齒狀病變定義為：一組以上皮鋸齒狀結構為特征的病

13、變,包括：①增生性息肉(hyperplastic polyp ,HP),根據(jù)黏液類型又分為微小泡型(microvesicula HP,MVHP)、杯狀細胞型(goblet cell rich HP,GCHP)和黏液缺乏型(mucin poor HP,MPHP)；②廣基鋸齒狀息肉/腺瘤(sessile serrated adenoma/polyp, SSA/P)；③傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma,

14、 TSA),并在結直腸癌亞型中分出鋸齒狀腺癌(serrated adeocarcinoma,SAC)。而且由于鋸齒狀病變命名分類的進展及對形態(tài)學特征解釋的不同,即使是經(jīng)驗豐富的胃腸病理學家之間也有明顯觀察差異,診斷一致率低；尤其是SSA/P和TSA在形態(tài)學診斷上存在著較大的挑戰(zhàn)性,
　　近年來研究認為,TSA和SSA/P具有明確的惡變潛能,分別通過傳統(tǒng)鋸齒狀通路和廣基鋸齒狀通路發(fā)生癌變。SSA/P可進展為微衛(wèi)星不穩(wěn)定結直腸癌,TS

15、A亦肯定可癌變,盡管癌變的分子類型不明確;但由于具有惡變潛能,應引起我們的注意和重視,但目前缺乏準確的診斷手段。因此本實驗通過探討41例SSA/P和23例TSA的臨床病理學,與結直腸癌癌變通路相關的6種免疫組織化學標志物,旨在增強對SSA/P和TSA形態(tài)與功能的認識,提高診斷的正確率,降低CRC的發(fā)病率。
　　[方法]：
　　收集北京軍區(qū)總醫(yī)院2007—2011間的結腸鏡活檢診斷為息肉和腺瘤的標本2418例,進行回顧性閱片。

16、所有切片按WHO(2010)標準,由3名病理醫(yī)師4～5輪閱片,篩選出鋸齒狀病變共291例。對上述291例鋸齒狀病變進行組織學診斷,從中篩選出41例SSA/P和23例TSA作為實驗組。并收集34例HP、24例正常腸組織和28例CRC作為對照組。所選選標本均進行免疫組化MGMT、MLH1、β-catenin、p16、CDX2、RUNX3和Ki-67染色。
　　[結果]：
　　SSA/P和TSA均好發(fā)于左半結腸。組織學顯示,SSA

17、/P鋸齒狀改變腺體緊靠黏膜肌層,基底隱窩呈倒“T”或“L”型分枝;TSA腺體可見明顯的鋸齒狀結構、異位隱窩和細胞異型增生;其中纖維絨毛狀TSA(FSA)兼具顯著鋸齒狀結構、典型畸形隱窩和長纖維絨毛狀突起特征,異型增生程度較高。免疫組化Ki-67陽性表達率和表達部位,在實驗組與對照組正常和HP之間表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);β-catenin、p16和RUNX3表達陽性率,在實驗組與對照組之間差異顯著(P<0.05)。
　

18、　[結論]：
　　1.SSA/P鋸齒狀改變腺體緊靠黏膜肌層,基底隱窩呈倒“T”或“L”型分枝;TSA腺體可見明顯的鋸齒狀結構、異位隱窩和細胞異型增生;FSA具有長纖維絨毛狀典型特征,異型增生程度較高。
　　2.β-catenin、p16和RUNX3免疫組化結果提示SSA/P和TSA較HP有明顯差異,這三個基因可能在SSA/P和TSA的發(fā)生及惡變過程中起重要作用。
　　3.免疫組化Ki-67結果提示在SSA/P和TSA具