鈣拮抗劑通過(guò)非鈣依賴(lài)磷脂酶A2介導(dǎo)的非L-型鈣通道阻斷作用抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的研究.pdf

1、鈣拮抗劑和本課題組研發(fā)的碘化氮正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide,F2）可阻斷心肌細(xì)胞L-型鈣通道，拮抗鈣超載，減輕心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷。前期研究[1-2]及文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道，在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）狀態(tài)下，鈣拮抗劑除了阻斷L-型鈣通道外，存在非L-型鈣通道依賴(lài)地保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。
　　iPL

2、A2是磷脂酶A2家族的一亞族，能夠水解膜磷脂，生成花生四烯酸（AA）和溶血磷脂，已經(jīng)在心肌，平滑肌，腎小管上皮等組織中鑒定出來(lái)，其中，在心肌中有相對(duì)較高的活性，已有研究報(bào)道，iPLA2能夠在磷脂的重塑、凋亡、血管舒縮的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的增殖、心肌缺血等方面發(fā)揮重要的作用[5~7]，肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放可以激活iPLA2且激活后發(fā)揮催化作用時(shí)不需要鈣離子的參與。本論文為了研究鈣拮抗劑的非L-型鈣通道阻斷作用，在建立心肌細(xì)胞胞外無(wú)鈣H/R模型的基礎(chǔ)上，

3、觀察iPLA2是否參與H/R損傷，鈣拮抗劑通過(guò)iPLA2及相關(guān)信號(hào)通路抗損傷作用的機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過(guò)Western blotting檢測(cè)H/R時(shí)iPLA2蛋白表達(dá)和SOD活性的時(shí)效關(guān)系，確定實(shí)驗(yàn)H/R模型的時(shí)間點(diǎn)。
　　2.分別用激動(dòng)劑LPS（或iPLA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）和拮抗劑BEL（或SiRNA干擾）使iPLA2在H/R時(shí)高表達(dá)和低表達(dá)，檢測(cè)氧自由基（SOD、MDA）、炎癥（AA）和早晚期凋亡的變化，得出i

4、PLA2的表達(dá)與無(wú)鈣H/R的“因果”關(guān)系。
　　3.在H/R的基礎(chǔ)上加上不同濃度的鈣拮抗劑（F2、Ver、Dil、Nif），用RT-PCR，Western blotting及酶活性試劑盒檢測(cè)iPLA2的表達(dá)，得出不同鈣拮抗劑對(duì)iPLA2表達(dá)的影響；同時(shí)檢測(cè)SOD、MDA、AA、MMP的變化，反映不同鈣拮抗劑抗心肌細(xì)胞H/R損傷的作用。
　　4.在H/R的基礎(chǔ)上用1×10-6M的鈣拮抗劑進(jìn)行處理后，孵育iPLA2的激動(dòng)劑脂多糖

5、（LPS），檢測(cè)iPLA2的活性，同時(shí)檢測(cè)SOD、MDA、AA的變化，來(lái)反映鈣拮抗劑抗心肌細(xì)胞H/R損傷是否通過(guò)iPLA2實(shí)現(xiàn)。
　　5. Western blotting檢測(cè) iPLA2、PKA、c-fos、PKC、p-ERK、p-JNK、p53的表達(dá)，Elisa檢測(cè) cAMP的表達(dá)。探討鈣拮抗劑抗 H/R損傷是否通過(guò)H/R---PKC---iPLA2---ERK---JNK---p53或者 H/R---iPLA2---cAMP

6、---PKA---c-fos信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。
　　結(jié)果：
　　1.與0Ca組比， H30min/R30min和H45min/R30min時(shí)， iPLA2蛋白顯著高表達(dá)（P<0.05）；缺氧45min后，SOD活性持續(xù)降低（P<0.05）。
　　2.與H/R組比，轉(zhuǎn)染iPLA2的質(zhì)粒或孵育激動(dòng)劑LPS后，iPLA2的蛋白和活性進(jìn)一步升高(P<0.01)，SOD活性進(jìn)一步下降，MDA和AA分泌也進(jìn)一步增加，晚期凋亡顯明加重（

7、P<0.01）；用SiRNA或抑制劑BEL干擾iPLA2的表達(dá)后，iPLA2的mRNA和活性則進(jìn)一步下降（P<0.05），SOD活性顯著恢復(fù)，MDA和AA分泌亦顯著減少，早晚期凋亡都得到抑制（P<0.01）。
　　3.與0Ca組比，H/R組iPLA2mRNA、蛋白、活性表達(dá)增加，SOD顯著性下降，MDA和AA分泌顯著增加，線粒體膜電位下降，早期凋亡加重（P<0.05），分別加上不同濃度的F2、Ver、Nif處理后，量效依賴(lài)地降低了

8、iPLA2的表達(dá)（P<0.05）；同時(shí)，顯著升高了SOD的活性，降低了MDA、AA的分泌，減輕了早起凋亡的發(fā)生（P<0.05）。而Dil對(duì)上述指標(biāo)無(wú)影響（P>0.05）。
　　4.與H/R組比，分別加上1×10-6M的F2、Ver、Nif，iPLA2的表達(dá)降低，孵育激動(dòng)劑LPS后，F(xiàn)2、Ver、Nif的作用不同程度地被抑制，顯著地增加了iPLA2的表達(dá)，降低了SOD活性，增加了MDA和AA的分泌。（P<0.05）
　　5.與

9、H/R組比，F(xiàn)2顯著的降低了iPLA2、p-ERK、PKA、c-fos的表達(dá)，增加了cAMP的表達(dá)（P<0.05），對(duì)PKCδ、p-JNK的表達(dá)無(wú)影響（P>0.05）；Ver、Nif對(duì)cAMP、PKA， c-fos，PKCδ，p-ERK，p-JNK無(wú)影響（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. iPLA2參與了心肌細(xì)胞無(wú)鈣H/R損傷，高表達(dá)和活性升高可加重?fù)p傷，低表達(dá)和活性降低可減輕損傷。
　　2.無(wú)鈣H/R可引起iP