microRNA-497對細(xì)胞凋亡和自噬介導(dǎo)的心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響.pdf

1、目的：
　　通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因Bcl-2和自噬相關(guān)基因LC3B是miR-497的預(yù)測靶基因，許多文獻(xiàn)曾報道這兩個基因均參與缺血再灌注過程。在非心肌細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-497能通過負(fù)性調(diào)節(jié)Bcl-2和Bcl-w[21]促進(jìn)缺血性神經(jīng)元凋亡，也能作為腫瘤抑制因子在腫瘤發(fā)生過程中起調(diào)節(jié)作用[22，23]。過表達(dá)miR-497增加人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中活性氧自由基形成，破壞線粒體膜電位以及誘導(dǎo)釋放細(xì)胞色素C[24]。上述

2、研究結(jié)果提示miR-497可能在心肌缺血和心力衰竭中發(fā)揮重要作用。本課題旨在揭示miR-497在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧和心肌組織缺血再灌注損傷中的調(diào)節(jié)作用及其機制，為心肌缺血再灌損傷提供新的治療靶點。
　　方法：
　　1.心肌梗死和缺血再灌注模型的建立和處理
　　2.細(xì)胞分離培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　3.缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型的建立和MTT細(xì)胞存活實驗
　　4.實時熒光定量PCR檢測microRNA含量
　　5.心

3、肌細(xì)胞和組織的凋亡自噬檢測手段
　　結(jié)果：
　　1.miR-497表達(dá)隨心?；蛐募〖?xì)胞缺氧時間延長而逐漸下調(diào)
　　Realtime PCR檢測miR-497均在小鼠的心、肺、腎、肝、腦組織中表達(dá)，尤以心臟中表達(dá)最高。隨著小鼠心梗時間延長，miR-497表達(dá)隨之下調(diào)。在細(xì)胞水平，單純?nèi)毖?h，6h，miR-497表達(dá)無明顯變化，但在缺氧24h后表達(dá)明顯下降。而心肌細(xì)胞缺氧后均相應(yīng)復(fù)氧2h，與常氧組相比，miR-497在A

4、3h/R2h時表達(dá)已明顯下調(diào)，并隨著缺氧時間延長，miR-497表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。上述結(jié)果提示miR-497可能參與心肌缺血特別是再灌注損傷的病理生理過程，表明miR-497與缺血再灌注損傷更為相關(guān)?；谝陨辖Y(jié)果，在后續(xù)實驗中，我們選擇了A3h/R2h作為刺激細(xì)胞條件。
　　2.Bcl2和LC3B是miR-497的直接靶基因
　　利用數(shù)據(jù)庫TargetScanHuman6.2和miRanda對miR-497的靶基因進(jìn)行預(yù)測，挑

5、選出抗凋亡基因Bcl-2和自噬相關(guān)基因LC3B作為研究對象。WB檢測發(fā)現(xiàn)心梗2w和4w的心肌組織中Bcl-2和LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平均較Sham組顯著升高。在細(xì)胞水平，心肌細(xì)胞單純A3h/R2h刺激后，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，LC3B-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)顯著上升。
　　3.miR-497-mimic誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和自噬
　　心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染50nM miR-497 mimic36h后，經(jīng)realtime PCR鑒

6、定，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組miR-497表達(dá)升高2倍以上。Hochest染色和TUNEL法發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞單純轉(zhuǎn)染miR-497mimic或單純給予A3h/R2h刺激后，細(xì)胞凋亡顯著增多。轉(zhuǎn)染miR-497mimic后給予A3h/R2h刺激，心肌細(xì)胞凋亡較單純A3h/R2h刺激增多。說明轉(zhuǎn)染miR-497mimic促使A3h/R2h刺激引起的凋亡進(jìn)一步增多(P＜0.01)。
　　MDC是標(biāo)記自噬體的特異性染料，MDC孵育細(xì)胞后共聚焦顯微

7、鏡下觀察，心肌細(xì)胞單純過表達(dá)miR-497自噬體數(shù)目無明顯變化，單純A3h/R2h刺激可誘導(dǎo)自噬體增加。而轉(zhuǎn)染miR-497 mimic的心肌細(xì)胞再給予A3h/R2h刺激后自噬體形成較單純A3h/R2h刺激時減少，表明miR-497能減少缺氧復(fù)氧刺激誘導(dǎo)形成的自噬體。同樣，應(yīng)用TEM可觀察到以上相同的結(jié)果。上述結(jié)果表明單純?nèi)毖鯊?fù)氧刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和自噬體增加;過表達(dá)miR-497增加缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減少缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的自噬體形

8、成。說明過表達(dá)miR-497在心肌細(xì)胞中有促凋亡和抗自噬的作用。
　　4.miR-497-sponge減少心肌細(xì)胞凋亡，增加自噬體形成
　　心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-miR-497-sponge48h后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)90％以上的細(xì)胞表達(dá)GFP綠色熒光蛋白。應(yīng)用Hochest染色和TUNEL法發(fā)現(xiàn)單純感染Ad-miR-497-sponge并不影響常氧狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡，而單純A3h/R2h刺激增加心肌細(xì)胞凋亡。抑制miR-497

9、后給予A3h/R2h刺激，心肌細(xì)胞凋亡較單純A3h/R2h刺激減少。MDC檢測顯示心肌細(xì)胞單純感染Ad-miR-497-sponge自噬體無變化，單純A3h/R2h刺激增加心肌細(xì)胞自噬體形成，心肌細(xì)胞感染Ad-miR-497-sponge后給予A3h/R2h刺激，自噬體較單純A3h/R2h刺激進(jìn)一步增加。以上結(jié)果說明抑制miR-497可以減輕缺氧復(fù)氧所致的心肌細(xì)胞損傷。
　　5.miR-497影響凋亡和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)
　

10、　WB結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-497 mimic的心肌細(xì)胞，Bcl-2，LC3B-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)明顯減少，Bax表達(dá)增加。而敲低miR-497與上述作用相反，并通過下調(diào)P62增加自噬流。基于以上結(jié)果，我們想進(jìn)一步探究敲低miR-497與自噬流的關(guān)系。應(yīng)用沉默beclin-1的腺病毒(Ad-sh-beclin-1)感染心肌細(xì)胞，或者加入溶酶體抑制劑巴弗洛霉素(Baf)或自噬抑制劑渥曼青霉素(Wor)等不同方法檢測LC3B-Ⅱ蛋白

11、表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Baf使LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)增加，而沉默beclin-1和Wor拮抗這一作用，反證敲低miR-497加強自噬流。以上結(jié)果在細(xì)胞水平上證明了過表達(dá)miR-497促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制自噬，而敲低miR-497減少細(xì)胞凋亡，通過下調(diào)P62加強自噬流。
　　6.miR-497影響缺氧復(fù)氧條件下細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)信號蛋白的表達(dá)
　　過表達(dá)或敲低miR-497的心肌細(xì)胞接受A3h/R2h刺激，LC3B-Ⅱ，beclin-1，B

12、cl-2和Bax均發(fā)生顯著變化。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-497的心肌細(xì)胞接受A3h/R2h刺激后，Bcl-2，LC3B-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)減少，而Bax表達(dá)增加。不論敲低或過表達(dá)miR-497，加入Baf后與相應(yīng)的對照組比beclin-1，LC3B-Ⅱ以及Bax的蛋白表達(dá)均增加，說明過表達(dá)miR-497抑制自噬流可激活細(xì)胞凋亡信號通路。而MTT細(xì)胞存活實驗說明單純過表達(dá)或敲低miR-497不影響細(xì)胞存活性，敲低miR-497后給

13、予心肌細(xì)胞A3h/R2h刺激，可改善單純?nèi)毖鯊?fù)氧刺激所致的細(xì)胞存活率降低。
　　7.心肌注射Ad-miR-497-sponge縮小心梗面積
　　為了闡明敲低心肌miR-497對缺血再灌注損傷的影響，我們于心肌直接注射Ad-miR-497-sponge或Ad-miR-497，2d后行冰凍切片確認(rèn)病毒感染效率達(dá)60％以上，注射病毒3d后制備心肌缺血再灌注模型。與Sham組相比，IR組miR-497表達(dá)明顯下調(diào)，而注射Ad-miR

14、-497-sponge的IR組，miR-497進(jìn)一步下調(diào)。單純注射Ad-miR-497的心肌組織miR-497表達(dá)顯著上調(diào)，而注射Ad-miR-497的IR組，miR-497表達(dá)的上調(diào)幅度減少。TTC染色發(fā)現(xiàn)與注射空載腺病毒組相比，注射Ad-miR-497-sponge組的心梗面積縮小，而注射Ad-miR-497組的心梗面積擴大。TEM觀察發(fā)現(xiàn)注射Ad-miR-497-sponge組的缺血再灌注小鼠心肌組織自噬體增加，TUNEL法顯示其

15、凋亡減少，而注射Ad-miR-497組的結(jié)果與之相反。
　　結(jié)論：
　　1.心肌缺血和心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧刺激時，miR-497表達(dá)水平明顯下調(diào)，而其預(yù)測靶基因Bcl-2和LC3B蛋白表達(dá)相應(yīng)上調(diào)，提示miR-497在缺血再灌注損傷時起重要作用。
　　2.過表達(dá)miR-497增加心肌細(xì)胞凋亡，抑制自噬流;而敲低miR-497減少心肌細(xì)胞凋亡，加強自噬流。敲低心肌細(xì)胞miR-497可改善缺氧復(fù)氧所致的細(xì)胞存活率下降。