鈣拮抗劑通過TNF-α-NF-κB環(huán)路介導(dǎo)的非鈣通道阻斷作用抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的研究.pdf

1、鈣拮抗劑（Calcium antagonists）是一類選擇性阻止電壓依賴性鈣通道，抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的藥物。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，鈣拮抗劑主要分為3類：二氫吡啶類，硫氮雜卓類，苯烷胺類。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide，F(xiàn)2）是我課題組研究合成的一個新化合物。前期研究表明，F(xiàn)2有拮抗鈣超載保護(hù)心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷或心肌

2、細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）損傷的作用。F2能夠激活非鈣依賴型PKCε轉(zhuǎn)位，保護(hù)心肌細(xì)胞H/R損傷；此外，在 L-型鈣通道缺失的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞上，F(xiàn)2對H/R損傷依然有保護(hù)作用。文獻(xiàn)報道，地爾硫卓、氨氯地平和維拉帕米可通過不依賴于改變細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的途徑影響轉(zhuǎn)錄因子N F-IL6和N F-κB的活性。上述研究結(jié)果提示，鈣拮抗劑對心肌細(xì)胞H/R損傷具有非鈣依賴的保護(hù)機(jī)制。腫瘤壞死因子（tumor

3、necrosis factor alpha, TNF-α）作為一種多功能的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等多種生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用。有文獻(xiàn)報道，心肌I/R及心肌細(xì)胞H/R刺激下，TNF-α激活且表達(dá)上調(diào)是導(dǎo)致心肌功能紊亂的一重要因素。結(jié)合前期的基因芯片數(shù)據(jù)，在無鈣液H/R模型中，TNF-α表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)2處理后TNF-α表達(dá)下調(diào)。提示我們，TNF-α可能參與無鈣液 H/R引起的心肌損傷。因此，本研究首先通過觀察無鈣液條件下H/R

4、心肌細(xì)胞中TNF-α的變化，及鈣拮抗劑對TNF-α表達(dá)的影響；進(jìn)一步探討無鈣液H/R時，H9C2心肌細(xì)胞是否介導(dǎo) TNF-α/NF-κB環(huán)路以及鈣拮抗劑是否可以通過調(diào)節(jié)此環(huán)路保護(hù)心肌細(xì)胞H/R損傷。
　　方法：
　　第一部分鈣拮抗劑對無鈣液H/R心肌細(xì)胞中TNF-α表達(dá)的影響
　　1.將培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分組：①對照(Ca2+1h)組；②無鈣液(0 Ca2+)組；③無鈣液缺氧復(fù)氧（0 Ca2+H/R）組；④無鈣

5、液+不同鈣拮抗劑組；⑤無鈣液+DMSO組；⑥無鈣液H/R+DMSO組；⑦無鈣液H/R+不同劑量鈣拮抗劑組。
　　2. Real-Time PCR方法檢測H9C2心肌細(xì)胞中TNF-αmRNA水平。
　　3. ELISA方法檢測H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α，IL-6，IL-10濃度。
　　4.線粒體膜電位（JC-1）方法檢測H9C2心肌細(xì)胞早期凋亡。
　　5.比色法檢測H9C2心肌細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH

6、）含量。
　　第二部分鈣拮抗劑對無鈣液H/R心肌細(xì)胞中TNF-α/NF-κB環(huán)路的影響
　　1.將培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分組：對照（Ca2+1h）組、無鈣液1h(0 Ca2+1h)組、無鈣液H/R組、無鈣液H/R+DMSO組、無鈣液H/R+F2組、無鈣液H/R+Ver組、無鈣液H/R+Dil組、無鈣液H/R+Nif組、無鈣液H/R+F2+TNF-α組、無鈣液H/R+Ver+TNF-α組、無鈣液H/R+TNF-α組、無鈣液

7、H/R+anti-TNF-αmab組、無鈣液1.0h+TNF-α組、無鈣液H/R+PDTC組、無鈣液H/R+LPS組,、control+P65組、control+vecter組。
　　2.ELISA方法檢測H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α，IL-6，IL-10濃度。
　　3.Western-blot法檢測無鈣液H/R H9C2心肌細(xì)胞p-P65，P65，p-IKB-α，IKB-α，p-IKKα/β， IK Kα/β蛋

8、白表達(dá)的變化。
　　4.線粒體膜電位（JC-1）方法檢測H9C2心肌細(xì)胞早期凋亡。
　　5.比色法檢測H9C2心肌細(xì)胞中LDH含量。
　　6.雙熒光素酶報告基因(Dual-Luciferase)檢測 H9C2心肌細(xì)胞 NF-κB Luciferase，TNF-αpromoter Luciferase熒光比值。
　　7.免疫熒光檢測H9C2心肌細(xì)胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果：
　　第一部分鈣拮抗劑對

9、無鈣液H/R心肌細(xì)胞中TNF-α表達(dá)的影響
　　1.無鈣液培養(yǎng)可刺激H9C2心肌細(xì)胞生成 TNF-α，無鈣液培養(yǎng)1h后隨著培養(yǎng)時間的延長釋放生成的TNF-α含量逐步升高，鈣拮抗劑對無鈣液培養(yǎng)所致TNF-α升高無影響。無鈣液中加入H0.5h/R0.5h刺激，可明顯激活H9C2心肌細(xì)胞釋放TNF-α，隨著無鈣液H/R時間的延長，培養(yǎng)液中TNF-α含量逐步升高。同時，無鈣液H/R可促進(jìn)H9C2心肌細(xì)胞釋放IL-6，LDH及減少IL-10

10、的生成。不同濃度的F2及Ver可劑量依賴地下調(diào)無鈣液H/R所致心肌細(xì)胞TNF-α，IL-6，LDH含量的升高及IL-10的降低，而Dil，N if對TNF-α表達(dá)上調(diào)無影響。
　　2.F2及Ver能劑量依賴地抑制無鈣液H/R所致H9C2心肌細(xì)胞中TNF-α mRNA的表達(dá)，而Dil，Nif對TNF-α的mRNA表達(dá)無影響。
　　3.F2及Ver能劑量依賴地抑制無鈣液H/R所致H9C2心肌細(xì)胞早期凋亡。
　　第二部分鈣拮

11、抗劑對無鈣液H/R心肌細(xì)胞中TNF-α/NF-κB環(huán)路的影響
　　1.無鈣液H/R可激活H9C2心肌細(xì)胞p-P65，p-IKB-α，p-IKKα/β蛋白表達(dá)，F(xiàn)2及Ver能下調(diào)其表達(dá)。而Dil，Nif對其表達(dá)無影響。
　　2. TNF-α單克隆抗體可下調(diào)無鈣液H/R所致p-P65，p-IKB-α，p-IKKα/β的高表達(dá)，抑制細(xì)胞LDH的漏出，減少早期細(xì)胞凋亡，降低炎癥因子IL-6，IL-10的釋放。重組大鼠TNF-α可拮抗

12、F2及Ver對無鈣液H/R心肌細(xì)胞p-P65，p-IKB-α，p-IKKα/β蛋白高表達(dá)的抑制作用，拮抗F2及ver的心肌保護(hù)作用。
　　3. NF-κB抑制劑PDTC可下調(diào)無鈣液H/R所致的TNF-α蛋白高表達(dá)。
　　4.無鈣液H/R可致NF-κB的信號轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，促使NF-κB Luciferase，TNF-αpromoter Luciferase熒光比值升高。F2及Ver對其具有抑制作用，加入外源TNF-α，LPS刺

13、激或轉(zhuǎn)染P65質(zhì)粒，可對抗F2及Ver的作用。
　　5.無鈣液H/R可致NF-κB從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，F(xiàn)2及Ver對其具有抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.無鈣液刺激可誘發(fā)H9C2細(xì)胞生成TNF-α。無鈣液條件下加入H/R可刺激TNF-α高表達(dá)，F(xiàn)2及Ver可抑制無鈣液H/R所致TNF-α高表達(dá)。
　　2.F2及Ver可通過TNF-α/NF-κB環(huán)路抑制TNF-α的表達(dá)可能是其抗H9C2心肌細(xì)胞無鈣液H/R損傷的