聚環(huán)氧乙烷對膿毒血癥休克大鼠脊斜肌微循環(huán)影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 嚴重感染所致的感染性休克是當前危重病醫(yī)學(xué)中首位死亡因素，醫(yī)療耗費巨大。雖然近年來在抗生素的使用、重癥監(jiān)護、支持治療等方面有了極大發(fā)展，但近10年死亡率并未出現(xiàn)下降趨勢。嚴重感染與感染性休克時因缺氧和酸中毒致使微循環(huán)瘀滯，血漿外滲，致使有效循環(huán)血量減少，血流分布異常，同時炎癥代謝產(chǎn)物與內(nèi)毒素的直接損傷等可共同導(dǎo)致血壓下降與組織器官灌注減少，其中缺氧和酸中毒時上述病理改變更為明顯。微循環(huán)障礙和炎癥反應(yīng)是其重要病理生

2、理基礎(chǔ)，改善微循環(huán)和減輕炎癥反應(yīng)是影響預(yù)后的關(guān)鍵。持續(xù)的微循環(huán)惡化導(dǎo)致多器官功能衰竭，最終導(dǎo)致死亡。臨床感染性休克治療中，液體復(fù)蘇是恢復(fù)血液動力學(xué)、組織/器官灌注的首要治療措施，但是經(jīng)過早期目標治療后，即使容量已恢復(fù)，微循環(huán)的障礙仍可能繼續(xù)存在。所以尋找一個更加有效的改善微循環(huán)的治療方法迫在眉睫。早期研究發(fā)現(xiàn)，微循環(huán)成像越差的患者預(yù)后越差，微循環(huán)改善快的感染性休克患者存活率高于微循環(huán)改善慢的患者，在發(fā)生休克后盡早改善微循環(huán)將明顯改善死亡

3、率。
　　 Toms等于上世紀50年代發(fā)現(xiàn)在流體中加入少量的高分子聚合物后，流動阻力明顯降低，在不改變驅(qū)動壓的情況下，流速增加。這種現(xiàn)象稱為Toms效應(yīng)(Tomseffect)，而這種高分子聚合物稱為減阻劑。國內(nèi)外多項研究報導(dǎo)減阻劑能夠阻止延緩動脈粥樣硬化的形成，有延緩糖尿病微血管病變、利尿及改善腎功能，減少機械作用對紅細胞的機械損傷等。這些作用可能與以下幾種機制有關(guān)。1:降低“血漿撇清效應(yīng)(plasmaskimmingeffe

4、ct)”，紅細胞懸液在微血管里流動時，在近管壁處會產(chǎn)生一個相對少細胞的區(qū)域，這種現(xiàn)象為“血漿撇清”，加入減阻劑可以顯著減少近管壁處的少紅細胞血漿層的厚度，使紅細胞重新分布于近管壁處，使得在動脈及毛細血管中血液-氣體交換更便利;2:增加紅細胞變形能力，使其更容易通過微循環(huán);3:降低血漿流動雷諾系數(shù)，使血漿流動湍流減少，降低血管阻力;4:降低“法-林效應(yīng):(Farhaeus-Lindqvisteffect)”逆轉(zhuǎn)的臨界半徑可以使紅細胞在通過

5、更小的微循阻力降低從而增加紅細胞向局部組織供氧;
　　 自上世紀70年代減阻劑開始應(yīng)用在醫(yī)學(xué)研究中，其主要作用是改善血流動力學(xué)，近年來逐漸發(fā)現(xiàn)減阻劑在改善糖尿病動物微循環(huán)障礙、急性心肌缺血動物的預(yù)后，失血性休克的再灌注及液體復(fù)蘇等方面都有一定的作用。國內(nèi)外尚未見其在感染性休克微循環(huán)方面的研究。本研究擬建立大鼠膿毒血癥休克模型，通過顯微鏡直接觀察脊斜肌微循環(huán)變化，探究減阻劑對感染性休克大鼠骨骼肌微循環(huán)的影響。
　　 材料與

6、方法：
　　 1、藥品與試劑
　　 聚環(huán)氧乙烷50000（PEOSigma公司）;0.9％氯化鈉注射液（山東魯抗）;3％戊巴比妥鈉（南方醫(yī)院實驗動物中心）。
　　 2、儀器
　　 監(jiān)護儀(飛利浦MP60);微量輸注泵（德國貝朗）;纖維素膜透析袋(Spectrum公司);正置熒光顯微鏡(ZEISS公司)+NIS-ELEMENT軟件。3K30低溫離心機（美國sigma公司）;8453紫光-可見分光光度計美國A

7、gilent公司）;動脈壓力傳感器;漩渦振蕩器MS3
　　 3、動物
　　 雄性SPF級Wistar大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)48只，體重180～200g。
　　 4、方法
　　 4.1、減阻劑制備
　　 精確稱取10mgPEO，加入10ml生理鹽水，配制成濃度為1000ppm的溶液。將配好的PEO溶液裝入分子截留量為40000Da的透析袋中，于生理鹽水中透析24小時。用生理鹽水將透析后的1

8、000ppm溶液稀釋為10ppm和50ppm存放于4攝氏度冰箱備用。
　　 4.2、動物模型制備
　　 在對膿毒癥的研究中，人們通常采用注射致死量大腸桿菌、注射內(nèi)毒素脂多糖(LPS)及CLP等方法建立膿毒癥的動物模型。本實驗感染模型采用盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)來建立，
　　 CLP模型是研究感染及相關(guān)疾病最常用的模型，是膿毒血癥實驗?zāi)Ｐ偷慕饦藴?，能夠比較真實的模擬感染的病理生理過程。此模型采用結(jié)扎盲腸末端并穿刺的

9、方法，使腸內(nèi)容物及菌群轉(zhuǎn)移入血并引發(fā)機體炎癥反應(yīng)。方法:體重180-200g雄性大鼠，3％戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，固定，備皮消毒。無菌手術(shù)。下腹部正中切口2cm，找出盲腸末端，結(jié)扎中下1/3處，（見圖1）注意勿損傷血管。14號針頭穿透并擠出少許腸內(nèi)容物，保證穿孔穿通。（見圖2）注意勿損傷腸系膜和血管。回納腸管，勿使扭轉(zhuǎn)避免梗阻，消毒切口縫合。術(shù)畢蘇醒后放回觀察，有膿毒血癥休克表現(xiàn)后進行試驗。每只動物手術(shù)操作和時間盡量保持一

10、致，以使試驗時模型感染程度盡量一致。在本研究中，CLP后大鼠逐漸出現(xiàn)萎靡、躁動、豎毛、腹瀉等表現(xiàn);處死動物后剖腹見腹腔有血性或膿性滲出液，帶惡臭，腸管脹氣，內(nèi)臟充血水腫失去原有光澤;表明動物模型的復(fù)制是成功的。
　　 4.3、試驗動物外科準備
　　 動物有休克表現(xiàn)后（統(tǒng)一14小時后）。腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后，固定并暴露右側(cè)腹股溝，右側(cè)股動脈切開穿刺插管，連接動脈測壓裝置，持續(xù)監(jiān)測動脈平均壓。靜脈插管進

11、行補液。暴露背部皮膚，分離脊斜肌并將脊斜肌置于顯微鏡下觀察微循環(huán)血流，持續(xù)滴入平衡液保持脊斜肌表面濕潤。間隔進行錄像采集局部微循環(huán)圖像。
　　 4.4、模型分組及數(shù)據(jù)采集
　　 模型隨機分為4組，聚環(huán)氧乙烷低劑量組（PE01組）持續(xù)泵入生理鹽水+10ppm聚環(huán)氧乙烷，聚環(huán)氧乙烷高劑量組（PE02組）持續(xù)泵入生理鹽水+50ppm聚環(huán)氧乙烷，生理鹽水對照組（NS組）持續(xù)泵入單純生理鹽水。復(fù)蘇時間為4小時，速度均為15ml/k

12、g/h，空白對照組（NT組）不進行液體復(fù)蘇，復(fù)蘇結(jié)束后縫合創(chuàng)口觀察生存時間。在復(fù)蘇開始前(T0)以及開始后10分鐘(T10)，30分鐘(T30)，60分鐘(T60)，120分鐘(T120)和240分鐘(T240)記錄微循環(huán)狀態(tài)。并在開始復(fù)蘇前，復(fù)蘇結(jié)束后和存活72小時后采集血液測乳酸濃度并留存血清標本檢測炎癥因子和肝腎功能。血清保留方法:血漿抗凝后3000r/min離心10分鐘取上清-80°冰箱保存。
　　 4.5、統(tǒng)計學(xué)處理<

13、br>　　 數(shù)據(jù)全部采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以(x)±s表示;組內(nèi)前后對比采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，組間比較采用One-WayNAOVA，檢驗標準以LSD方法，P＜0.05為差異有顯著性。圖表使用SPSS13.0和office2007制作。
　　 結(jié)果：
　　 1、對心率和血壓的影響。
　　 除NT組血壓逐漸下降，在復(fù)蘇結(jié)束時低于其余三組（p＜0.05），其余各組間血壓心率均無明顯變化。

14、
　　 2、對大鼠脊斜肌小動脈管徑和紅細胞流速的影響。
　　 四組在復(fù)蘇前后及各組間比較血管管徑并無顯著變化，所測量血管的直徑為37.20±7.75(μm)。RBC流速PE01組給藥后顯著增快，10分鐘時即達到峰值（2228.93±292.86vs3115.70±375.95p=0.000），其后持續(xù)給藥可維持穩(wěn)定，速度有所下降但不顯著，復(fù)蘇結(jié)束時明顯快于復(fù)蘇前(2228.9±292.9vs2759.7±215.7p=0

15、.001)。PE02組給藥后RBC流速同樣顯著加快，之后迅速下降致復(fù)蘇前水平，并不能維持。NS組RBC流速減慢但不顯著(p＞0.05)。NT組則持續(xù)下降，實驗結(jié)束時(T240)顯著低于實驗開始時(T0)(p=0.004)。各組間相比，在給藥10分鐘后PE01組.PE02組RBC流速快于NS組和NT組(p＜0.05)，PE02組在給藥60分鐘后速度下降至NS組和NT組水平(p＞0.05)，而PE01組則維持較快的RBC流速至復(fù)蘇結(jié)束。NS

16、組間各時間點RBC流速無明顯差異。而NT組結(jié)束時則要低于其余3組（p＜0.05）。
　　 3、大鼠血漿IL-6、TNF-α和血乳酸濃度變化以及復(fù)蘇4小時乳酸清除率。
　　 血乳酸濃度除NT組復(fù)蘇前后無明顯變化，其余三組復(fù)蘇后乳酸濃度均明顯低于復(fù)蘇前（p＜0.01），組間相比復(fù)蘇后PE01組，PE02組和NS組三組血乳酸濃度均明顯低于NT組（p＜0.05），相應(yīng)的乳酸清除率也明顯高于NT組（p＜0.05）。PE01組復(fù)蘇后

17、血乳酸濃度比NS組和PE02組稍低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，而乳酸清除率是明顯高于NS組和PE02組(p＜0.05)表1。而血漿IL-6和TNF-α濃度組間和組內(nèi)比較均無明顯變化（p＞0.05）
　　 4、大鼠最終生存時間變化。
　　 每組12只大鼠納入實驗，PE01組72小時后存活5只，存活率為41.7％。NS組72小時后有2只存活，存活率為16.7％。PE02組僅有一只存活，存活率為8.3％。而NT組則沒有一直存活超過48小

18、時。平均生存時間PE01組53±5.7小時明顯長于NT組的26±4.1小時和NS組的34±5.8小時。而PE02組為37±4.8小時，和NS組無明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.低濃度(10ppm)聚環(huán)氧乙烷能夠加速血乳酸的清除，降低實驗動物學(xué)乳酸濃度，改善膿毒血癥休克大鼠預(yù)后，顯著提高實驗動物生存時間。
　　 2.低濃度(10ppm)聚環(huán)氧乙烷對微循環(huán)管徑?jīng)]有影響，能夠顯著提高膿毒血癥休克大鼠脊斜肌微循環(huán)血流