天然雙特異性抗體的產(chǎn)生及其生物學特性的初步研究.pdf

1、目的：
　　 通過構(gòu)建產(chǎn)生天然雙特異性抗體的新西蘭大白兔動物模型，鑒定天然雙特異性抗體的產(chǎn)生。初步探討了天然雙特異性抗體的生物學特性，及其天然特異性抗體的產(chǎn)生機制。為臨床靶向治療和自身免疫疾病機制的探討提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 用過碘酸鈉氧化法將半抗原地高辛(Dig)與載體牛血清白蛋白(BSA)和銅藍蛋白(KLH)交聯(lián)，制備免疫原。同時用同樣方法做半抗原和載體蛋白的辣根過氧化物酶(HRP)標記，用于EL

2、ISA免疫分析。
　　 構(gòu)建八組實驗動物模型，每組雌雄各半。實驗動物沿脊索多位點皮下免疫乳化的抗原2mg，三個月后進行加強免疫，計量減半。二個月后進行第二次加強免疫。二個月后第三次加強免疫，一周后采血。應(yīng)用雙抗原夾心法測定各組單特異性抗體和雙特異性抗體的產(chǎn)生情況。并應(yīng)用雙抗原夾心抑制法進一步堅定雙特異性抗體的存在。
　　 以BSA-Dig組為例純化雙特異性抗體一抗BSA和抗Dig。純化方法依次經(jīng)過50％(NH4)SO4沉

3、淀，蛋白A親和層析，BSA-Sepharos4B親和層析和Dig-Sepharose4B親和層析。每次純化后都進行單特異性抗體和雙特異性抗體的檢測，以及抗體純度的SDS-PAGE鑒定。最后獲得較純的抗BSA和Dig的雙特異性抗體。同時會獲得較純的抗BSA和抗Dig單特異性抗體。
　　 50％(NH4)SO4沉淀后的免疫血清進行分子篩，觀察產(chǎn)生峰值的情況。同時峰進行單特異性抗體和雙特異性抗體ELISA分析，SDS-PAGE電泳分析

4、，從而初步鑒定雙特異性抗體亞型。應(yīng)用抗人IgG單克隆抗體亞型IgG1，IgG2，IgG3和IgG4鑒定純化后的雙特異性抗體亞型。
　　 對于雙特異性抗體產(chǎn)生機制的初步探討，利用谷胱甘肽作為還原劑進行雙特異性抗體體內(nèi)交換實驗，利用Balb/c裸鼠和新西蘭大白兔進行雙特異性抗體體外交換實驗。
　　 結(jié)果：
　　 Dig與載體BSA的交聯(lián)率約為7.3，Dig與載體BSA的交聯(lián)率約為0，1mmol/mgKLH。Dig，D

5、NP，BSA和KLH與HRP的標記最適反應(yīng)濃度分別為1:500，1:200，1:200和1:800。
　　 在載體和半抗原交聯(lián)免疫組都有相應(yīng)雙特異性抗體的存在，而對照組沒有。同時雌性比雄性動物的滴度高。雙特異性抗體產(chǎn)生的規(guī)律與單特異性抗體產(chǎn)生的規(guī)律相似。
　　 載體和半抗原交聯(lián)免疫免疫組血清經(jīng)過系列純化后獲得較純的雙特異性抗體。免疫血清50％(NH4)SOP4沉淀后的分子篩結(jié)果顯示雙特異性抗體可為IgG和IgM。純化后的

6、雙特異性抗體與抗人IgG單克隆抗體亞型IgG1，IgG2，IgG3和IgG4鑒定后發(fā)現(xiàn)雙特異性抗體無型特異性，主要為IgG2和IgG4。
　　 經(jīng)雙特異性抗體體內(nèi)交換實驗和體外交換實驗證實雙特異性抗體可以體外和在同類動物體內(nèi)產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：
　　 雙特異性抗體可以在新西蘭大白兔天然產(chǎn)生。雙特異性抗體不僅在交聯(lián)的載體和半抗原之間產(chǎn)生，而且在同時免疫的交聯(lián)的載體和半抗原對之間隨機組合產(chǎn)生。雌性動物比雄性動物更易產(chǎn)