基于雙特異性抗體的熱帶傳染病快速偵檢方法的研究.pdf

1、熱帶傳染病是威脅我軍指戰(zhàn)員身體健康的重要疾病。部隊官兵熱帶傳染病自我防護意識比較薄弱且進入新環(huán)境因缺乏免疫力等而極易感染熱帶傳染病。由于部隊執(zhí)行多樣化的軍事任務，迫切需要建立熱帶傳染病偵檢、診治和防控相關技術，應對熱帶傳染病的威脅。瘧疾屬于蟲媒傳染病，由瘧原蟲寄生人體紅細胞引起，被WHO列入的8大熱帶病之一，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區(qū)，且近年來瘧原蟲對抗瘧藥普遍具有抗藥性，潛在危害極大。恙蟲病是由恙蟲病東方體感染人體而引起的蟲媒傳染病，近

2、年來在我國的流行區(qū)域有不斷擴大延伸的趨勢。我國南海島嶼地處熱帶，常年多雨，溫暖潮濕，是各種病原體滋生的溫床，有調查顯示該地區(qū)大部分區(qū)域是恙蟲病的疫源地。由于駐守海島的部隊多為外來人群，對該類傳染病的免疫力低，發(fā)病率較高，嚴重影響了部隊各項任務的完成，是我國南方戰(zhàn)區(qū)造成非戰(zhàn)斗減員的重要傳染病。
　　部隊軍事作業(yè)及戰(zhàn)時的特點都要求建立快速、便捷、無需或較少借助儀器的診斷方法。為了建立這樣一種滿足現(xiàn)場使用要求的熱帶傳染病快速偵檢方法，我

3、們引入了基因工程雙特異性抗體BsAb，它是將兩種針對不同抗原的單克隆抗體A和B的重、輕鏈可變區(qū)以非共價鍵、共價鍵或亮氨酸拉鏈、螺旋-轉角-螺旋等蛋白質結構域連接形成的重組抗體分子。利用基因工程雙特異性抗體可同時結合兩種不同的抗原的特性，如構建抗人紅細胞/抗病原體抗原的雙特異性抗體，該BsAb可同時分別結合人紅細胞和血液中病原體，形成可見的紅細胞的集聚，從而對病原體感染做出診斷檢測。
　　本課題在制備了抗惡性瘧原蟲裂殖子表面抗原、抗

4、恙蟲病東方體外膜抗原以及抗人紅細胞膜表面非凝集抗原的單克隆抗體雜交瘤細胞的基礎上，通過RT-PCR分別獲得cDNA，以其為模板，利用設計的多對引物PCR擴增得到各單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)目的基因片段VH、VL。設計拼接引物，利用重疊延伸PCR法，將抗瘧原蟲裂殖子表面抗原的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)目的基因片段通過連接肽序列拼接得到抗-瘧原蟲裂殖子表面抗原的單鏈抗體scFv目的基因片段;將抗人紅細胞膜表面非凝集抗原的單克隆抗體的重鏈

5、和輕鏈可變區(qū)目的基因片段與抗恙蟲病東方體外膜抗原的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)目的基因片段通過兩個短連接肽序L10(SAKTTPKLGG)和一個長連接肽序列LL(RADAAAA(G4S)4)拼接得到抗-人紅細胞膜表面非凝集抗原/抗-恙蟲病東方體外膜抗原的雙特異性抗體BsAb目的基因片段。同時分別在其N端引入畢赤酵母真核表達系統(tǒng)中信號肽前導序列，在其C端引入6×His標簽序列。將這些基因片段分別克隆至畢赤酵母分泌表達載體pPIC9K，電轉

6、化畢赤酵母菌GS115并誘導表達，先通過SDS-PAGE電泳分析確定疑似目的蛋白條帶后，再應用Western blot檢測目的蛋白的表達。獲得的確定有目的蛋白表達的上清后續(xù)可經(jīng)鎳柱純化得到電泳純重組抗體。
　　本研究中，我們通過重疊延伸PCR獲得抗-瘧原蟲裂殖子表面抗原的單鏈抗體scFv和抗-人紅細胞膜表面非凝集抗原/抗-恙蟲病東方體外膜抗原的雙特異性抗體BsAb目的基因片段。將抗-瘧原蟲裂殖子表面抗原的單鏈抗體scFv克隆至畢赤

7、酵母分泌表達載體pPIC9K上進行誘導表達，SDS-PAGE和Western blot檢測分析重組蛋白的表達，得到的重組蛋白大小與理論分子量相符。間接免疫熒光實驗結果表明該單鏈抗體可與瘧原蟲裂殖子表面蛋白識別并結合，從而檢測到瘧原蟲感染，具有與親本抗體相似的識別結合能力。將抗-人紅細胞膜表面非凝集抗原/抗-恙蟲病東方體外膜抗原的雙特異性抗體重組基因片段克隆至畢赤酵母真核分泌表達載體pPIC9K進行誘導表達，SDS-PAGE和Wester