抗人VEGF及OPN雙特異性抗體的制備及生物學活性研究.pdf

1、血管生成對腫瘤的生長和轉移有著重要作用，使腫瘤的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長階段轉變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，促進腫瘤增殖、侵襲。新生血管的生長和成熟是一個復雜的多因子和多信號傳導過程的結果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管內皮生長因子(VEGF)。VEGF能與細胞表面的血管內皮生長因子受體結合，通過激活酪氨酸激酶信號轉導途徑發(fā)揮功能，可以促進內皮細胞增殖、遷移，誘導血管形成，促進腫瘤持續(xù)生長，并提高血管通

2、透性，引起周圍組織纖維蛋白沉著，促進單核細胞、成纖維細胞內、皮細胞侵潤，有利于腫瘤基質形成和腫瘤細胞進入新生血管，促進腫瘤轉移。大量結果證明，VEGF在促進腫瘤血管生成過程中起重要作用，阻斷VEGF被認為是當前最為有效的抗腫瘤治療方法之一。 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是個多因素多機制多種因子參與的過程。有研究發(fā)現，在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌和肺癌等多種癌組織中均可發(fā)現骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)表達增加。進一步研究

3、發(fā)現，人骨橋蛋白是一種含314個氨基酸殘基的磷酸化糖蛋白，含有凝血酶的的酶切位點，參與調節(jié)細胞骨架重構、細胞凋亡、細胞增殖和遷移等過程，且OPN受體和血管重建關系密切，整合素αvβ3和OPN的共同表達可以刺激內皮細胞遷移。Hirama等證實，OPN在腫瘤生長過程中新生血管形成的機制起到了重要的作用。因此，抑制OPN的活性可阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤的生長。 大量研究表明，VEGF和OPN在血管生成的機制中有很大關聯．VEGF可誘

4、導內皮細胞編碼αvβ3的mRNA增加，使新生血管表面有αvβ3高水平表達．而VEGF同樣也可以誘導編碼OPN的mRNA增加，而OPN是αvβ3的配體，二者相互作用可促進內皮細胞遷移．VEGF可以迅速增加微血管的通透性，導致包括凝血因子在內的血漿蛋白濃度增高，上調一些蛋白分子的表達，如生長因子，粘附分子，蛋白酶，蛋白酶受體，易于激活外源性凝血途徑，產生凝血酶，促進OPN的酶切。體外實驗結果證實，經凝血酶酶切的OPN，其粘附力比未經酶切者強

5、，能大大提高內皮細胞的遷移速度，促進微血管的生成。此外，OPN還能激活Brk/NF-nB/ATF-4信號轉導途徑來誘導VEGF的表達，并促進VEGF誘導內皮細胞增生的作用，進而促進新生血管形成，加快腫瘤細胞的生長及轉移。所以，如果能阻斷OPN，不但可以抑制其促腫瘤血管生成的作用，還可以下調VEGF的表達，進而阻止VEGF介導的腫瘤新生血管的形成。 由上可知，如果能同時阻斷VEGF和OPN，不但可以抑制VEGF的促血管生成的功能和

6、OPN的促進腫瘤轉移的功能，還將降低內源性VEGF的表達，進而可進一步抑制VEGF的促血管生成作用，并減少其介導的OPN的酶切，從而抑制OPN的促進血管生成和腫瘤轉移的功能，故可能會比單獨阻斷VEGF或OPN有更好的抑制腫瘤生長轉移的協同作用，對腫瘤的治療將具有重要意義。 Genentech公司的抗癌新藥Avastin(抗VEGF人源化抗體)已于2004年2月獲得美國FDA批準上市，用于一線治療轉移性結直腸癌，并有望用于其它腫

7、瘤，包括非小細胞肺癌和腎癌的治療。我們前期的研究得到一個特異性抗OPN的人源化抗體hu1A12，該人源化抗體，可特異性阻斷OPN，在體內外有明顯的抗腫瘤活性。若將Avastin和hu1A12聯合應用，可同時阻斷VEGF和OPN，進一步提高抗腫瘤治療效果。但是，單抗聯合應用具有很多限制。首先，臨床上同時應用兩種抗體的的安全性和效果至今未有詳盡的報道，可能存在安全風險；另外，聯合應用兩種抗體也存在調節(jié)障礙和造價太高的缺陷，限制了其臨床應用。

8、 采用基因工程技術構建的雙特性抗體可以同時阻斷兩個靶點。在本研究中，我們設計了一種新型的可同時阻斷VEGF和OPN的雙可變區(qū)的人源化抗體DVD(dual-variable-domain)-IgAVOPN，并在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中獲得了高效表達。我們構建的該人源化DVD-Ig AVOPN來源于兩個特異的人源化抗體，即抗VEGF的人源化單克隆抗體Avastin和抗OPN的人源化單抗hu1A12。將Avastin的重鏈可變區(qū)通過AS

9、TKGP構成的linker與hu1A12的重鏈可變區(qū)的N末端串聯在一起構成了AVOPN的重鏈可變區(qū)，然后與抗體的Fc段連接，構建出AVOPN的重鏈基因；將Avastin的輕鏈可變區(qū)通過TVAAP構成的linker與hu1A12的輕鏈可變區(qū)的N末端串聯在一起構成了AVOPN的輕鏈可變區(qū)，然后用overlap的方法連接上CK，構建出AVOPN的輕鏈基因。將上述輕重鏈基因分別裝入真核表達載體pcDNA3.1(+)，共轉染CHO細胞，weste

10、rnblot檢測正確表達后，挑選出穩(wěn)定高表達的克隆大量擴增表達，收集培養(yǎng)上清以rProteinA凝膠層析柱純化，SDS-PAGE檢測蛋白，鑒定了蛋白分子量與理論分子量相符，純度可達90％。ELISA結合實驗表明該DVD-Ig可同時結合VEGF和OPN，且與VEGF的親合力和Avstin相似，與OPN的親合力和hu1A12相似，說明該DVD-Ig結構既可有原來兩種抗體的特異性，又保留了母源抗體的親合力。 用人臍靜脈內皮細胞增殖試驗

11、、劃痕修復試驗檢測該DVD-IgAVOPN對VEGF和OPN的阻斷作用。實驗結果表明AVOPN可有效地抑制VEGF和OPN介導的人臍靜脈內皮細胞增殖及劃痕修復，與Avastin和hu1A12聯合使用達到近似效果。右脅側接種LM3腫瘤細胞的裸鼠用DVD-Ig AVOPN進行治療，實驗結果表明DVD-IgAVOPN具有比Avastin和hu1A12單獨使用有更好的抑制血管生成作用，可顯著抑制腫瘤的生成和轉移，與兩倍劑量的Avastin和hu