高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞表面分子特異性結(jié)合肽的篩選及其生物學(xué)功能.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞表面分子特異性結(jié)合肽的篩選及其生物學(xué)功能姓名：莢衛(wèi)東申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：湯釗猷20060401博士論文中文摘要能肝癌細(xì)胞表面特異性結(jié)合肽。為使篩選到的特異性結(jié)合肽具有代表性，我們采取差減篩選策略，先將噬菌體肽庫與MHCC97L共育，這樣得到的新噬菌體肽庫就消除了與MHCC97L細(xì)胞表面結(jié)合的非特異性噬菌體，然后再篩選與HCCLM3細(xì)胞表面結(jié)合的噬菌體。由于MHCC97L和HCC

2、LM3具有相似的遺傳背景，從而消除了不同樣本由于遺傳背景不同而固有的性狀差異，將混雜因素減少到最低。研究顯示：經(jīng)過3輪連續(xù)差減篩選，回收率從39010弓增加到11510～，陽性噬菌體克隆得到有效的富集；隨機(jī)挑選48個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行DNA序列分析，獲得11種肽序列，其中展示Ala—Trp—Tyr—Pro—Leu—Pro—Pro(AWYPLPP)肽的噬菌體被高度富集，占第3輪噬菌體克隆的77％(37／48)。噬菌體體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示：所獲得的

3、11種噬菌體克隆與HCCLM3細(xì)胞表面的結(jié)合效率明顯高于對照空白噬菌體(33～278倍；平均為47倍)，其中AWYPLPP噬菌體與HCCLM3的結(jié)合效率是對照空白噬菌體的278倍。將AwYPLPP序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Blast)進(jìn)行同源序列搜索，結(jié)果顯示所得到的蛋白質(zhì)主要為細(xì)胞外或細(xì)胞表面蛋白、腫瘤特異性抗原及前體、底物蛋白等，如可能與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白一1(ECMl)，同源性為71％。上述結(jié)果表明

4、，采用BRAS]L噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)和差減篩選策略，獲得了11種與高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞表面分子的結(jié)合肽，其中為首的結(jié)合肽為AwYPIPP。2高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞表面分子特異性結(jié)合肷的鑒定本部分的研究目的采用噬菌體體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、抗噬菌體免疫細(xì)胞化學(xué)染色、免疫熒光染色和激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)以及噬菌體結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)，利用具有不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株，對高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞表面結(jié)合肽(AWYPLPP肽)的特異性進(jìn)行鑒定。本課題的

5、初衷是篩選高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合肽，盡管AwYPLPP噬菌體對高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株HCCLM3展示了良好的選擇性，但不能確保AWYPLPP噬菌體可以與高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞結(jié)合。我們選擇了7種不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株，包括：高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株(MHCC97、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6)，低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株(MHCC97L、PLC／PRE／5)和無轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株Hep3B，正常人肝細(xì)胞株CCLl3(即