胺碘酮與唑類藥物的聯(lián)合抗真菌作用及機(jī)制研究.pdf

1、近半個世紀(jì)以來，隨著醫(yī)藥科技的迅猛發(fā)展，臨床上抗生素的使用日趨廣泛，很容易引起人們發(fā)生菌群失調(diào)；而及免疫抑制劑、激素、抗腫瘤化療和細(xì)胞毒性藥物等的大量應(yīng)用，可以降低機(jī)體的免疫機(jī)能；再加上留置導(dǎo)管、血液透析、消化道內(nèi)窺等的侵入性操作增加了病源菌感染的機(jī)會；這些風(fēng)險因素單獨(dú)或相互疊加起作用使條件致病菌一尤其是真菌感染的發(fā)生率正在不斷上升，念珠菌屬特別是白色念珠菌的臨床分離率最高。真菌感染發(fā)展迅速，如果得不到及時治療，可導(dǎo)致患者死亡。與此同時

2、，隨著抗真菌藥物的大量應(yīng)用，其選擇壓力可將耐藥菌變?yōu)閮?yōu)勢菌，并誘導(dǎo)真菌發(fā)生基因突變，從而使真菌耐藥率不斷增加，真菌感染的治療越來越困難。聯(lián)合用藥作為解決耐藥真菌感染的主要方法之一，成為近年來的研究熱點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。 抗心律失常藥物胺碘酮(amiodarone，AMD)是治療心房顫動的一線用藥，是預(yù)激綜合癥伴頑固性心律失常病人的首選藥物。最新文獻(xiàn)報道胺碘酮具有新奇的廣譜的殺真菌活性，且與小劑量氟康唑聯(lián)用時具有協(xié)同抗真菌作用。本實(shí)

3、驗(yàn)在全面測定了胺碘酮與唑類藥物單用或聯(lián)合應(yīng)用的靜態(tài)和動態(tài)抗真菌作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了胺碘酮對唑類抗真菌藥物的增敏作用機(jī)制，并觀察了藥物作用對真菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。 一、胺碘酮與唑類藥物的靜態(tài)聯(lián)合抗真菌作用參照修訂后的CLSI M27-A2方案，設(shè)置胺碘酮濃度范圍0.5～256μg/ml，氟康唑濃度范圍0.25～256μg/ml，伊曲康唑和伏立康唑濃度范圍0.008～64μg/ml進(jìn)行藥物的抗真菌作用測定。結(jié)果表明CA5，CA

4、8，CAl2，CAl4，CAl29為敏感白色念珠菌，CA1O，CA15，CA16，CA135，CA137為唑類交叉耐藥白色念珠菌；胺碘酮對所有菌株的抗真菌作用都很弱。 應(yīng)用棋盤法測定胺碘酮與唑類藥物對上述白色念珠菌的靜態(tài)聯(lián)合抗真菌作用，設(shè)置胺碘酮濃度范圍0.125-8μg/ml，氟康唑濃度范圍O.125～128μg/ml，伊曲康唑和伏立康唑濃度范圍0.008-8μg/ml，以分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)(FICI法)、反映面模型(RSM法)

5、、非參數(shù)反應(yīng)面(AE法)三種方法進(jìn)行全面評價。結(jié)果顯示藥物聯(lián)合對白色念珠菌耐藥株的FICI的平均值為0.010；RSM法的協(xié)同拮抗參數(shù)ICα均大于0，且其對應(yīng)的95％致信區(qū)間也大于0：AE法的協(xié)同百分?jǐn)?shù)和(∑SYN)的平均值為1250％，拮抗百分?jǐn)?shù)和(EANT)的平均值為-18.7％，即聯(lián)合用藥對耐藥菌表現(xiàn)協(xié)同作用。同時，實(shí)驗(yàn)測得藥物聯(lián)合對白色念珠菌敏感株的FICI的平均值為1.84；RSM法各組的協(xié)同參數(shù)α均大于O，但其對應(yīng)的95％致

6、信區(qū)間均包含0；△E法的∑SYN的平均值為59％，EANT的平均值為-138.5％，即聯(lián)合用藥對敏感菌表現(xiàn)為無關(guān)作用。對三種評價方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，非參數(shù)法更適用于評價抗真菌藥物與非抗真菌藥物的聯(lián)合作用效果。 二、胺碘酮與唑類藥物的動態(tài)聯(lián)合抗真菌作用應(yīng)用時間.殺菌曲線法測定胺碘酮與唑類藥物對耐藥白色念珠菌CA10、敏感白色念珠菌CA14的動態(tài)聯(lián)合抗真菌作用。篩選出胺碘酮藥物濃度4μg/ml，氟康唑藥物濃度8μg/ml，伊曲康唑和伏

7、立康唑藥物濃度0.5μg/ml進(jìn)行測定。在體系培養(yǎng)的第O、6、12、24、48h的時間點(diǎn)，通過活菌計(jì)數(shù)和XTT(二甲氧唑黃法)兩種方法獲得真菌細(xì)胞數(shù)量，并對第48h菌液濃度的常用對數(shù)值(Log10CFU/ml)進(jìn)行分析比較。結(jié)果顯示動態(tài)聯(lián)合抗真菌作用測定證實(shí)了胺碘酮本身弱的抗真菌活性；證實(shí)了胺碘酮對唑類藥物抗耐藥菌的協(xié)同作用，即與唑類藥物相比，聯(lián)合用藥菌濃度常用對數(shù)下降值≥2；證實(shí)了胺碘酮對唑類藥物抗敏感菌的無關(guān)作用，即與唑類藥物相比，

8、聯(lián)合用藥菌濃度常用對數(shù)下降值≤1。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)活菌計(jì)數(shù)法與XTT法具有良好的一致性，相關(guān)系數(shù)r=0.9622. 三、細(xì)胞外的鈣調(diào)節(jié)與藥物作用應(yīng)用平板劃線法測定胺碘酮與唑類藥物對耐藥白色念珠菌CAl0、CAl37，敏感白色念珠菌CA8、CAl4的聯(lián)合抗真菌作用以及細(xì)胞外的鈣調(diào)節(jié)對聯(lián)合作用的影響。設(shè)置4.5xl05CFU/ml的菌液劃線接種于含有一定濃度胺碘酮、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑以及各種鈣調(diào)節(jié)劑的YPD瓊脂培養(yǎng)基上，3

9、5℃恒溫培養(yǎng)48h。結(jié)果顯示，胺碘酮顯著增強(qiáng)了唑類藥物對耐藥菌的作用，稍稍增強(qiáng)了唑類藥物對敏感菌的作用；鈣通道激活劑BayK8644不影響聯(lián)合用藥的效果；低濃度鈣離子對耐藥菌敏感菌都有生長促進(jìn)作用，可以減弱聯(lián)合用藥的效果；高濃度鈣離子、鈣離子絡(luò)合劑EGTA、EDTA$t耐藥菌敏感菌都有生長抑制作用，可以增強(qiáng)聯(lián)合用藥的效果；鈣通道阻滯劑貝尼地平可顯著增強(qiáng)聯(lián)合用藥對耐藥菌的作用，稍稍增強(qiáng)聯(lián)合用藥對敏感菌的作用。 四、胺碘酮增敏作用與

10、胞內(nèi)鈣離子的關(guān)系Fluo-3/AM是跨膜的鈣熒光指示劑，可以迅速與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合，經(jīng)可見光激發(fā)后發(fā)出熒光，定性反映細(xì)胞內(nèi)的鈣離子脈沖變化。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定藥物聯(lián)合作用對耐藥白色念珠菌CAlO細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響。菌株在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以D-Hanks緩沖液清洗細(xì)胞，重懸并調(diào)節(jié)菌濃度約為107CFU/ml，37℃ 120mm下3μ的Fluo-3/AM避光負(fù)載30min，流式細(xì)胞儀測定藥物加入后細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。結(jié)果

11、顯示，胺碘酮可增加基礎(chǔ)鈣的雙相升高(第一相和第三相)，這與胺碘酮的弱抗真菌作用一致；氟康唑?qū)?xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響較小，但可以將基礎(chǔ)鈣的低水平雙相升高逆轉(zhuǎn)為單相升高(第二相)；胺碘酮對唑類藥物抗耐藥菌的增敏作用在于促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)鈣庫的鈣的釋放，極大的提高了胞漿內(nèi)鈣離子濃度。 五、胺碘酮對細(xì)胞內(nèi)唑類藥物蓄積的影響羅丹明6G(Rhodamine 6G，R6G)是一種熒光物質(zhì)，可被動擴(kuò)散進(jìn)入真菌細(xì)胞，與氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同為白色

12、念珠菌主動外排泵CDR(CandidaDrug Resistance)的底物。我們應(yīng)用熒光法測定胺碘酮對白色念珠菌蓄積羅丹明6G的影響，并進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究藥物對白色念珠菌吸收、泵出羅丹明6G的影響。耐藥菌CAl0、CAl35，敏感菌CA8和CAl4在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用YPD液體培養(yǎng)液測定羅丹明6G在細(xì)胞內(nèi)的蓄積情況，采用不含糖PBS體系測定羅丹明6G在細(xì)胞內(nèi)的吸收情況，采用含5％糖的PBS體系測定羅丹明6G

13、在細(xì)胞內(nèi)的泵出情況。 結(jié)果顯示，胺碘酮對耐藥菌的增敏作用機(jī)制在于增加了藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，這一作用是由藥物吸收增加而不是泵出減少引起的；胺碘酮對敏感菌細(xì)胞蓄積、吸收、泵出羅丹明6G的過程均無明顯影響。 六、藥物作用對白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)的影響應(yīng)用光學(xué)顯微鏡，在1000倍油鏡下觀察胺碘酮與唑類藥物對白色念珠菌耐藥株CA10、敏感株CA14形態(tài)學(xué)的影響。藥物作用6h的結(jié)果表明，細(xì)菌及組織染色方法大多數(shù)也可用于真菌細(xì)胞形態(tài)觀察。