熱帶假絲酵母菌對唑類抗真菌藥物的耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、目的：明確熱帶假絲酵母菌對唑類藥物的耐藥機(jī)制。
　　方法：連續(xù)3個月從上海市、安徽省、江蘇省、河南省和廣東省的6家三甲醫(yī)院共收集了147株熱帶假絲酵母菌，利用微量肉湯稀釋法測定氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑?qū)釒Ъ俳z酵母菌的MIC值。采用REP-PCR和MLST技術(shù)對147株熱帶假絲酵母菌進(jìn)行基因分型。選取所有耐藥株和21株敏感株，分別從外排泵、氧化呼吸和藥物作用靶酶的改變等方面進(jìn)行耐藥機(jī)制的研究。通過羅丹明6G外排實驗和羅丹明123

2、染色流式分析比較耐藥株和敏感株外排泵和線粒體膜電位的差異，并利用real-time RT-PCR檢測外排相關(guān)基因CDR1和MDR1、呼吸鏈上基因CYTb以及靶酶編碼基因 ERG11的表達(dá)，同時通過液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測麥角固醇的含量。對ERG11基因全長進(jìn)行擴(kuò)增和測序，尋找突變位點。利用PRODIGE方法構(gòu)建erg11Δ的釀酒假絲酵母菌，驗證ERG11突變位點與唑類藥物敏感性之間的關(guān)系。最后對同時分離自同一患者的對氟康唑敏感的

3、白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌進(jìn)行氟康唑體外誘導(dǎo)，比較三種假絲酵母菌對氟康唑的耐藥易感性和耐藥機(jī)制。
　　結(jié)果：147株熱帶假絲酵母菌中18株對氟康唑耐藥，21株對伊曲康唑耐藥，4株對伏立康唑耐藥。其中，4株同時對氟康唑和伊曲康唑交叉耐藥，另有4株對三種唑類藥物均耐藥。REP-PCR與MLST在熱帶假絲酵母菌的基因分型中分型結(jié)果一致。147株熱帶假絲酵母菌共產(chǎn)生A～H8種REP-PCR型，分別對應(yīng)MLST的ST146

4、、新型1、ST136、ST127、ST177、ST169、新型2和 ST117。與敏感組相比，耐藥組的外排泵無明顯增強(qiáng)作用，CDR1和MDR1基因的表達(dá)量也無顯著增加。耐藥組比敏感組攝入更多的羅丹明123（p<0.05），在加入呼吸抑制劑NaN3后平均熒光強(qiáng)度下降的程度也明顯大于敏感組（p<0.05），但兩者CYTb基因的表達(dá)量沒有顯著差異。耐藥組ERG11基因的表達(dá)水平明顯高于敏感組，并且耐藥程度越嚴(yán)重，ERG11的表達(dá)水平以及麥角固

5、醇生成的量越高。測序發(fā)現(xiàn)耐藥株的 ERG11存在突變位點 Y132F和S154F，將克隆有ERG11mut的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入erg11Δ的釀酒假絲酵母菌，發(fā)現(xiàn)其對三種唑類藥物的MIC值均增加。體外誘導(dǎo)結(jié)果顯示，光滑假絲酵母菌最易在氟康唑誘導(dǎo)下變?yōu)槟退幹?，而三種酵母菌的耐藥機(jī)制也不盡相同，其中熱帶假絲酵母菌體外誘導(dǎo)耐藥株的ERG11基因表達(dá)顯著增加。
　　結(jié)論：熱帶假絲酵母菌唑類耐藥株的外排泵作用無增強(qiáng)，氧化呼吸不存在缺陷，其對唑類藥