偏硅酸鈉對氧化低密度脂蛋白引起的ECV304細(xì)胞株炎癥損傷的影響.pdf

1、目的：動物實驗研究證實偏硅酸鈉（Na2SiO3）能從許多環(huán)節(jié)抑制高脂血癥條件下動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的形成和發(fā)展，提示Na2SiO3在抗AS作用方面有潛在重要研究價值。本實驗用Na2SiO3干預(yù)ECV304細(xì)胞株，旨在觀察偏硅酸鈉對氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）引起的ECV304細(xì)胞炎癥損傷的影響，進(jìn)一步探討偏硅酸鈉可能的抗AS的作用機(jī)制。

2、
　　 方法：
　　 1.低密度脂蛋白的分離、氧化和鑒定
　　 采用化學(xué)沉淀法提取低密度脂蛋白（LDL）。將LDL置于10μmol/L CuSO4溶液中，37℃避光氧化24 h，經(jīng)PH為7.4的PBS透析24 h，過濾除菌，得ox-LDL，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外分光法檢測氧化產(chǎn)物OD值及氧化程度，考馬斯亮藍(lán)法測定濃度。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 常規(guī)方法培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，分別設(shè)對照

3、組、損傷組、Na2SiO3高濃度組（硅68.5 mg/L）、Na2SiO3中濃度組（硅34.2mg/L）、Na2SiO3低濃度組（硅17.1 mg/L）。觀察各組細(xì)胞情況。
　　 3.指標(biāo)檢測
　　 硝酸還原酶法和放射免疫分析法分別檢測培養(yǎng)液中NO和IL-8含量，化學(xué)比色法檢測細(xì)胞中NOS活性，Western blotting檢測iNOS蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞VCAM-1蛋白表達(dá)。提取細(xì)胞總RNA，用RT-PCR方

4、法對iNOS、IL-8、VCAM-1、LOX-1、NOX4 mRNA水平進(jìn)行分析。此外還檢測了單個核細(xì)胞黏附數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1.LDL的提取和氧化結(jié)果
　　 化學(xué)沉淀法所得LDL的瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶，與正常血清中LDL條帶處于同一水平。LDL氧化產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶，泳動速率較LDL快近一倍。提示LDL的提取及氧化成功。LDL氧化曲線顯示氧化程度于10小時左右已達(dá)到完全。
　

5、　 2.細(xì)胞培養(yǎng)液NO濃度變化
　　 損傷組NO濃度較對照組明顯降低（P<0.01），偏硅酸鈉高，中，低濃度組NO濃度較損傷組顯著升高（P<0.01）。
　　 3.細(xì)胞NOS、iNOS活性和iNOS蛋白表達(dá)的變化
　　 損傷組NOS活性較對照組明顯降低（P<0.01），iNOS活性和蛋白表達(dá)量較對照組明顯升高（P<0.01），偏硅酸鈉高，中，低濃度組NOS活性較損傷組顯著升高（P<0.01），而iNOS活性明顯

6、低于損傷組（P<0.01）。偏硅酸鈉中濃度組iNOS蛋白表達(dá)量明顯低于損傷組（P<0.01）。
　　 4.細(xì)胞iNOS mRNA水平的變化
　　 損傷組iNOS mRNA水平較對照組顯著升高（P<0.01）。中濃度偏硅酸鈉組iNOS mRNA水平較損傷組顯著降低（P<0.01）。
　　 5.單個核細(xì)胞黏附數(shù)
　　 損傷組單個核細(xì)胞黏附數(shù)均較對照組明顯升高（P<0.01）；Na2SiO3高、中、低濃度組較損

7、傷組明顯下降（P<0.01）。
　　 6.培養(yǎng)液IL-8水平變化
　　 損傷組IL-8較對照組明顯升高（P<0.01），偏硅酸鈉高、中、低濃度組IL-8含量較損傷組明顯降低（P<0.01）。
　　 7.細(xì)胞VCAM-1蛋白表達(dá)量變化
　　 損傷組VCAM-1蛋白表達(dá)較對照組顯著升高（P<0.05）。中濃度偏硅酸鈉組VCAM-1蛋白表達(dá)較損傷組顯著降低（P<0.05）。
　　 8.細(xì)胞IL-8 mR

8、NA水平的變化
　　 損傷組IL-8 mRNA水平顯著高于對照組（P<0.01），中濃度偏硅酸鈉對ECV304細(xì)胞IL-8 mRNA的水平有明顯下調(diào)作用（P<0.01）。
　　 9.細(xì)胞VCAM-1 mRNA水平的變化
　　 損傷組的VCAM-1 mRNA水平顯著高于對照組（P<0.01），中濃度偏硅酸鈉組mRNA水平顯著低于損傷組（P<0.01）。
　　 10.LOX-1 mRNA水平的變化
　　

9、 損傷組的LOX-1 mRNA水平顯著高于對照組（P<0.01），中濃度偏硅酸鈉組mRNA的水平顯著低于損傷組（P<0.01）。
　　 11.NOX4 mRNA的變化
　　 損傷組的NOX4 mRNA水平顯著高于對照組（P<0.01），中濃度偏硅酸鈉組mRNA水平顯著低于損傷組（P<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 Na2SiO3具有抑制ox-LDL誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞損傷的作用，通過下調(diào)IL-8、V