硫化氫對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)吞氧化型低密度脂蛋白的影響.pdf

1、目的：探討外源性硫化氫對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)吞氧化型低密度脂蛋白的影響，并對(duì)其分子學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步探討，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：采用組織貼塊法從大鼠腹主動(dòng)脈分離培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)。培養(yǎng)基選用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。培養(yǎng)3～5天有細(xì)胞爬出，7～9天可進(jìn)行第一次傳代。實(shí)驗(yàn)選用3～4代VSMC。根據(jù)不同檢測(cè)方

2、法可分為：①用于MTT檢測(cè)細(xì)胞活性的細(xì)胞接種于96孔板，按5×104/mL細(xì)胞密度每孔200μl;②用于油紅O染色、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞接種于放有小圓玻片的24孔板內(nèi)，按1×105/ml細(xì)胞密度每孔1ml;③．用于免疫印跡檢測(cè)的細(xì)胞接種于無(wú)菌6孔板中，按lx106/ml細(xì)胞密度，每孔2ml。
　　 實(shí)驗(yàn)分組：
　　 1、MTT法檢測(cè)H2S對(duì)VSMC活性影響：分為對(duì)照組、NaHS(25、50、100、200、500、10

3、00μmol/L)組；
　　 2、油紅O染色檢測(cè)VSMC脂質(zhì)含量與免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CD36、LOX-1受體表達(dá)：分為對(duì)照組、ox-LDL（80μg/ml）組、ox-LDL(80μg/ml）+NaHS(50μmol/L)組、ox-LDL(80μg/ml)+PPG(3mmol/L)組；
　　 3、DiI-oxLDL內(nèi)吞的檢測(cè)：分為DiI-oxLDL（10μg/ml）組，DiI-oxLDL（10μg/ml）+NaHS(50μ

4、mol/L)組，Dil-oxLDL(10g/ml)+PPG(3mmol/L)組；
　　 4、Westernblot測(cè)定VSMC的CD36、LOX-1蛋白表達(dá)：分為對(duì)照組、ox-LDL(80μg/ml)組、ox-LDL(80μg/ml)+NaHS(25、50、100、200μmol/L)組。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT結(jié)果顯示，NaHS濃度在200μmol/L，以下時(shí)，對(duì)VSMC的活力沒(méi)有明顯影響，當(dāng)NaHS濃

5、度增加到500和1000μmol/L后細(xì)胞活力明顯下降。
　　 2．通過(guò)油紅O染色觀察外源性H2S(以NaHS為供體)對(duì)VSMC脂質(zhì)攝取的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，VSMC與ox-LDL單獨(dú)孵育后胞內(nèi)脂質(zhì)顯著增多，當(dāng)用CSE(胱硫醚-γ-裂解酶)抑制劑PPG作用后，脂質(zhì)沉積更明顯，而H2S處理后的VSMC胞內(nèi)脂質(zhì)明顯減少。
　　 3．用DiI-oxLDL處理VSMC，Confocal觀察VSMC對(duì)ox-LDL的內(nèi)吞作

6、用，主要觀察外加DiI-oxLDL在VSMC胞內(nèi)的積聚。結(jié)果觀察到H2S能抑制VSMC對(duì)ox-LDL的內(nèi)吞，而PPG則增強(qiáng)這種內(nèi)吞作用，與油紅O染色結(jié)果相符。
　　 4．免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)VSMC的CD36、LOX-1受體表達(dá)，對(duì)H2S抑制VSMC內(nèi)吞ox-LDL的分子學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步探討。結(jié)果顯示，ox-LDL能明顯誘導(dǎo)VSMC的CD36、LOX-1受體表達(dá)，H2S處理后可下調(diào)這兩種受體的表達(dá)，PPG作用后則使CD36、LOX-

7、1受體表達(dá)上調(diào)。
　　 5．為進(jìn)一步確定H2S抑制VSMC內(nèi)吞脂質(zhì)的機(jī)制是否與其下調(diào)CD36、LOX-1有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)還采用了Westernblot方法分析NaHS對(duì)VSMC的CD36、LOX-1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ox-LDL顯著增強(qiáng)誘導(dǎo)VSMC的CD36、LOX-1蛋白表達(dá)，而H2S對(duì)兩種受體蛋白表達(dá)的抑制作用呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 1．外源性H2S可通過(guò)抑制VSMC對(duì)ox-LDL的內(nèi)吞減少脂