血管緊張素Ⅱ?qū)ERG通道蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）是由腎素、血管緊張素以及其受體構(gòu)成的重要體液系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的正常生理功能與高血壓、心肌肥大、充血性心力衰竭等諸多心血管的病理過(guò)程中具有重要作用。RAS不僅存在于體液系統(tǒng)，而且在包括心臟、血管在內(nèi)的許多組織中也有RAS，在局部調(diào)節(jié)生理病理過(guò)程。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是該系統(tǒng)發(fā)揮作用的主要體液因子，其受體有1型（AT1）和2型（AT2）兩種。近幾年大規(guī)

2、模的臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)血管緊張轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI）抑制AngⅡ的合成或AT1受體阻斷劑可能因減少致命性心律失常的發(fā)生而明顯降低病人死亡率。實(shí)驗(yàn)表明，抑制RAS可有效治療缺血再灌誘發(fā)的心律失常。ACE抑制劑和AT1受體阻斷劑成為目前臨床高血壓、心衰病人治療的重要藥物。然而，這些藥物潛在抗心律失常的機(jī)制尚不清楚。
　　 心肌肥厚、心衰時(shí)最突出的

3、表現(xiàn)是心肌細(xì)胞復(fù)極化過(guò)程變慢，而導(dǎo)致動(dòng)作電位的延長(zhǎng)，為細(xì)胞產(chǎn)生后除極、尖端扭轉(zhuǎn)性室速等心律失常創(chuàng)造了前提條件。實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)人AngⅡ基因的大鼠經(jīng)常因嚴(yán)重室性心動(dòng)過(guò)速而猝死；選擇性心肌組織過(guò)表達(dá)AngⅡ基因的小鼠在不增加循環(huán)AngⅡ水平的情況下出現(xiàn)明顯復(fù)極化延遲，伴高發(fā)的室性心律失常；與上述結(jié)果相似，Rivard等新近報(bào)道，心臟特異性過(guò)表達(dá)人類AT1受體基因小鼠瞬時(shí)外向K+電流（Ito）、超快激活的延遲整流電流（IKur）及內(nèi)向整流電

4、流（IK1）均下調(diào)造成復(fù)極延遲，動(dòng)作電位延長(zhǎng)，伴自發(fā)室性心律失常。特別值得注意的是，年幼的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物即存在復(fù)極化延遲及高發(fā)的心律失常，而此時(shí)并不存在組織肥厚性重構(gòu)，表明電生理改變并非繼發(fā)于肥厚性重構(gòu)，而是刺激AT1受體直接引起離子通道的改變。有實(shí)驗(yàn)表明，在分離的大鼠和犬的心室肌細(xì)胞及表達(dá)編碼Ito通道基因Kv4.3的哺乳細(xì)胞上，AngⅡ均可減小Ito電流密度。上述結(jié)果提示除通過(guò)肥厚型組織重構(gòu)引發(fā)心臟電生理改變外，AngⅡ直接對(duì)離子通道的

5、調(diào)節(jié)作用可能是病理性電重構(gòu)的重要因素。然而，心室復(fù)極化K+電流存在明顯的種屬差別，Ito是大鼠小鼠的主要復(fù)極化電流，而大動(dòng)物、人的復(fù)極化電流主要是IKr和IKs。目前認(rèn)為，人心肌中IKr由human ether-a-go-go-related gene（HERG）編碼。迄今為止，有關(guān)AngⅡ?qū)?fù)極起關(guān)鍵作用的Ikr的調(diào)節(jié)作用了解極少。在前期的實(shí)驗(yàn)里我們首次觀察了AngⅡ?qū)﹄嗍笮氖壹?xì)胞IKr和表達(dá)HERG電流的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ通過(guò)

6、激動(dòng)AT1受體抑制IKr/HERG電流延緩心室細(xì)胞的復(fù)極過(guò)程，此過(guò)程主要由細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路中介。然而AngⅡ?qū)Kr調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。
　　 因此本研究利用分子生物學(xué)的方法，在豚鼠心室肌細(xì)胞上觀察AT1受體與HERG通道的分布及其可能的關(guān)系，并在豚鼠心室肌細(xì)胞和異源表達(dá)系統(tǒng)上觀察了AngⅡ?qū)ERG通道表達(dá)的影響，為AngⅡ下調(diào)HERG電流的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一健康成年豚鼠左室游離壁H

7、ERG通道及AT1受體蛋白表達(dá)及相互關(guān)系
　　 目的：觀察健康成年豚鼠左心室跨壁心肌層HERG通道及AT1受體蛋白分布及兩者之間的相互關(guān)系。
　　 方法：在急性分離的豚鼠心室肌細(xì)胞下分別取內(nèi)、中、外三層心肌細(xì)胞膜，提取蛋白，用蛋白質(zhì)電泳的方法測(cè)定HERG通道及AT1受體蛋白在各層的分布。用免疫共沉淀及免疫熒光方法確定兩者分布相關(guān)性。
　　 結(jié)果：（1）HERG通道蛋白在豚鼠左室游離壁分布不一致。內(nèi)膜下心肌最少，中

8、層和外膜下心肌層沒(méi)有明顯差別。（2）AT1受體蛋白在豚鼠左室游離壁分布不一致。中膜最少，內(nèi)膜外膜沒(méi)有明顯差別。（3）免疫共沉淀表明，AT1受體蛋白與HERG蛋白結(jié)構(gòu)存在交聯(lián)。（4）免疫熒光表明，AT1受體蛋白與HERG蛋白在豚鼠心肌細(xì)胞上分布一致。
　　 結(jié)論：HERG蛋白與AT1受體蛋白在正常豚鼠左室游離壁分布均存在跨壁異質(zhì)性；HERG與AT1受體在細(xì)胞膜上分布一致，且二者以復(fù)合物形式結(jié)合。
　　 二血管緊張素Ⅱ?qū)Τ墒?/p>

9、HERG通道蛋白表達(dá)的影響
　　 目的：在共轉(zhuǎn)染HERG和AT1受體的HEK-293細(xì)胞及急性分離的豚鼠左室游離壁細(xì)胞，觀察AngⅡ長(zhǎng)時(shí)間與細(xì)胞孵育后對(duì)HERG通道成熟蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：用Lipofectin2000轉(zhuǎn)染試劑將AT1基因轉(zhuǎn)染到穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)染的HERG-HEK293細(xì)胞，用蛋白質(zhì)電泳確定AT1受體成功轉(zhuǎn)染后，觀察不同濃度AngⅡ在不同時(shí)間對(duì)HERG通道成熟蛋白表達(dá)的影響；急性分離的豚鼠左室游離壁細(xì)胞，

10、與100 nM AngⅡ孵育6小時(shí)，觀察HERG通道成熟蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：（1）孵育AngⅡ10 nM、100 nM、1μM后24小時(shí)可抑制HERG通道蛋白表達(dá)，孵育10 min沒(méi)有明顯影響HERG通道蛋白的表達(dá)。（2）孵育AngⅡ100 nM2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，與對(duì)照相比在12 h后HERG通道成熟蛋白表達(dá)開(kāi)始下降。（3）對(duì)于急性分離豚鼠心肌左室游離壁細(xì)胞，AngⅡ孵育6小時(shí)對(duì)HERG通道蛋