Visfatin對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞增殖及腎素-血管緊張素系統(tǒng)表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景:
　　 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。DN的確切發(fā)病機(jī)制不明，目前認(rèn)為受多方面因素的影響，包括代謝因素、血流動(dòng)力學(xué)因素、氧化應(yīng)激、遺傳因素等。近年來(lái)慢性低度炎癥及固有免疫系統(tǒng)的激活在DN的發(fā)病中受到越來(lái)越多的重視，多種炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18等通過(guò)自分泌和旁分泌方式導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)而參與DN

2、發(fā)病。有學(xué)者提出把糖尿病腎臟疾病看作一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病。
　　 內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)是新近識(shí)別的一種脂肪細(xì)胞因子，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)功能，在多種不同細(xì)胞中Visfatin激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等的表達(dá)，參與了一大類急慢性炎癥相關(guān)疾病如急性肺損傷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)病。在2型糖尿病病人中，血漿Visf

3、atin濃度升高、是2型糖尿病的獨(dú)立相關(guān)因素，并且與肌酐清除率呈負(fù)相關(guān)、與尿白蛋白排泄率呈正相關(guān)。Cha研究小組的結(jié)果更是顯示遺傳性2型糖尿病大鼠腎小球及腎間質(zhì)Visfatin水平均比對(duì)照組大鼠升高；這些大鼠在DN早期時(shí)血漿Visfatin濃度就明顯升高，并與微量白蛋白尿呈正相關(guān)；大鼠腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、近端腎小管細(xì)胞均表達(dá)并分泌Visfatin，而Visfatin能進(jìn)一步促進(jìn)上述三種腎臟固有細(xì)胞表達(dá)促纖維化分子及細(xì)胞外基質(zhì)，提示炎

4、癥因子Visfatin也在DN的發(fā)病中起一定的作用。而Visfatin以何種機(jī)制參與DN的發(fā)病?尚待研究。
　　 大量研究表明，腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的過(guò)度激活是DN發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。RAS的主要效應(yīng)分子血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)除了血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)作用之外，還作為促生長(zhǎng)、促纖維化及促炎因子導(dǎo)致腎臟功能損害，其中AngⅡ與NF-κB的相互激活介導(dǎo)

5、的級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)起了關(guān)鍵作用。如前述，有研究顯示Visfatin可激活NF-κB，而NF-κB又可激活A(yù)ngⅡ，如此推斷，Visfatin是否通過(guò)激活RAS通路而參與DN發(fā)病呢?系膜細(xì)胞是腎小球中功能最活躍的一類細(xì)胞，在病理狀態(tài)下大量增殖，分泌炎癥因子，并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腎臟病變進(jìn)展。Visfatin參與DN發(fā)病，是否也對(duì)系膜細(xì)胞有直接促增殖作用呢?本課題以大鼠腎系膜細(xì)胞為模型，研究Visfatin對(duì)系膜細(xì)胞增殖及RAS表達(dá)的直接

6、調(diào)節(jié)作用，以期從細(xì)胞增殖方面研究Visfatin對(duì)DN的致病作用及闡明局部RAS激活在Visfatin參與DN發(fā)病中的可能作用。
　　 研究目的:
　　 1.觀察Visfatin對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞增殖的影響。
　　 2.觀察Visfatin對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞RAS主要成員：腎素、血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE

7、)、AngⅡ、血管緊張素Ⅱ受體1(AngⅡ type1 receptor，AT1)和血管緊張素Ⅱ受體2(AngⅡ type2 receptor，AT2)的直接調(diào)節(jié)作用。
　　 研究方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 在37℃、5％CO2環(huán)境中，用含10％胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70％-80％融合時(shí)，改用含1％FCS的低糖

8、DMEM同步化過(guò)夜。
　　 2.重組大鼠Visfatin干預(yù)實(shí)驗(yàn)
　　 不同終濃度(0、1、10、100、200ng/ml)Visfatin干預(yù)系膜細(xì)胞24h及100ng/mlVisfatin干預(yù)細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)(0、12、24、48h)，觀察Visfatin對(duì)系膜細(xì)胞增殖影響的濃度效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)。
　　 不同終濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin干預(yù)系膜細(xì)胞48h，觀察Visfatin對(duì)系膜細(xì)胞R

9、AS主要成員mRNA及蛋白表達(dá)影響的濃度效應(yīng)。
　　 不同終濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin干預(yù)系膜細(xì)胞48h及100ng/mlVisfatin干預(yù)細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)(0、12、24、48h)，觀察Visfatin對(duì)系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液AngⅡ生成影響的濃度效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)。
　　 3.CCK-8試劑盒WST-8法檢測(cè)系膜細(xì)胞增殖。
　　 4.Real time-PCR檢測(cè)系膜細(xì)胞腎素、AGT、ACE

10、、AT1、AT2 mRNA表達(dá)。
　　 5.Western Blot檢測(cè)系膜細(xì)胞AGT、AT1蛋白表達(dá)。
　　 6.放射免疫法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中AngⅡ活性。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組正態(tài)分布的數(shù)據(jù)或經(jīng)轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，多組間兩兩比較采用最小有意義差異(least signifi

11、cant difference，LSD)t檢驗(yàn)。顯著性水準(zhǔn)為P＜0.05。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.Visfatin對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響
　　 系膜細(xì)胞與不同濃度(0、1、10、100、200ng/ml)Visfatin孵育24h，隨著Visfatin濃度增高，細(xì)胞增殖逐漸增多，呈劑量依賴性，Visfatin濃度自10ng/ml起，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 系膜細(xì)胞與100ng/ml V

12、isfatin孵育不同時(shí)長(zhǎng)(0、12、24、48h)，隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖逐漸增多，呈時(shí)間依賴性。孵育時(shí)間自12h起，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；孵育時(shí)間為24h時(shí)，細(xì)胞增殖達(dá)到頂峰；延長(zhǎng)孵育時(shí)間至48h細(xì)胞增殖不再繼續(xù)增加。
　　 2.Visfatin對(duì)系膜細(xì)胞腎素、AGT、ACE、AT1、AT2 mRNA表達(dá)的影響
　　 系膜細(xì)胞與不同濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin孵育48h，隨著V

13、isfatin濃度增高，腎素、AGT、AT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，呈劑量依賴性，Visfatin濃度自10ng/ml起，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而ACE、AT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在Visfatin刺激前后保持不變。
　　 3.Visfatin對(duì)系膜細(xì)胞AGT、AT1蛋白表達(dá)的影響
　　 系膜細(xì)胞與不同濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin孵育48h，隨著Visfatin濃度增高，AGT蛋

14、白表達(dá)逐漸升高，呈劑量依賴性，Visfatin濃度自10ng/ml起，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AT1蛋白表達(dá)在Visfatin濃度為100ng/ml時(shí)與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.Visfatin對(duì)系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液AngⅡ生成的影響
　　 系膜細(xì)胞與不同濃度(0、1、10、100ng/ml)Visfatin孵育48h，隨著Visfatin濃度增高，細(xì)胞上清液AngⅡ含量逐漸增多，呈劑量依賴性，Vi

15、sfatin濃度自1ng/ml起，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 系膜細(xì)胞與100ng/ml Visfatin孵育不同時(shí)長(zhǎng)(0、12、24、48h)，隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞上清液AngⅡ含量逐漸增多，呈時(shí)間依賴性。孵育時(shí)間自12h起，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；孵育時(shí)間為24h時(shí)，AngⅡ含量達(dá)到頂峰；延長(zhǎng)孵育時(shí)間至48hAngⅡ含量不再繼續(xù)增多。
　　 結(jié)論:
　　 1.Visfatin以時(shí)間及劑量

16、依賴方式促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖。
　　 2.大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)腎素、AGT、ACE、AT1及AT2。
　　 3.Visfatin以劑量依賴方式促進(jìn)系膜細(xì)胞AGT mRNA及蛋白表達(dá)，以時(shí)間及劑量依賴方式促進(jìn)系膜細(xì)胞AngⅡ生成。
　　 4.Visfatin促進(jìn)系膜細(xì)胞腎素mRNA表達(dá)，而對(duì)ACE mRNA表達(dá)無(wú)影響。
　　 5.Visfatin促進(jìn)系膜細(xì)胞AT1 mRNA及蛋白表達(dá)，而對(duì)AT2 mRNA表達(dá)