GDF15表達(dá)及其H6D遺傳變異與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一類危害嚴(yán)重的常見消化道惡性腫瘤。雖然目前我國人民的生活水平和醫(yī)療條件都得到了很大的提升，但由于社會發(fā)展帶來的環(huán)境問題以及人們生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率依然呈現(xiàn)上升的趨勢。目前對于結(jié)直腸癌早期診斷和治療的研究雖然取得了很大進(jìn)展，但對于晚期結(jié)直腸癌的治療還沒有取得令人欣慰的成果，這部分患者的生存并沒有得到根本的改善，死亡率依舊居高不下。因此，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)

2、展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，積極尋找新的分子標(biāo)志物，對結(jié)直腸癌的預(yù)防、早期診斷和個體化治療以及患者生存質(zhì)量的提升均具有重要的意義。
　　結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個極其復(fù)雜的過程，它的形成機(jī)制目前還不十分清楚。我們實(shí)驗室一直以結(jié)直腸癌為疾病模型研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及篩選診斷預(yù)后標(biāo)志物;2010年我們通過差異分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)生長分化因子15（Growth differentiation factor15，GDF15）是結(jié)腸組織中高特異性表達(dá)

3、的一個分泌蛋白，并且它在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞株SW620的培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解液中的表達(dá)顯著高于來源于同一結(jié)直腸癌病人的原發(fā)灶細(xì)胞株SW480。這些結(jié)果提示，GDF15可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。鑒于此，我們實(shí)驗室在隨后的工作中對GDF15在結(jié)直腸癌中的作用開始了一系列的研究。
　　GDF15是轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF-β）超家族成員，定位于19號染色體的p13.11上。

4、我們的前期研究顯示，結(jié)直腸癌患者血清中的GDF15水平明顯高于正常人群，而且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人又高于無轉(zhuǎn)移的病人。mRNA水平也發(fā)現(xiàn)GDF15在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯比正常組織高。免疫組織化學(xué)結(jié)果證實(shí)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌病人的癌組織GDF15表達(dá)水平明顯高于無轉(zhuǎn)移的患者。這些結(jié)果都表明，GDF15與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可以作為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。但GDF15在結(jié)直腸癌中的轉(zhuǎn)移機(jī)制以及它對預(yù)后的影響仍不清楚。本課題在上述研究

5、工作基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)不同結(jié)直腸癌細(xì)胞GDF15 CDS(codingsequence)區(qū)第604位堿基存在C和G的不同，經(jīng)查閱相關(guān)資料，發(fā)現(xiàn)這是一個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(rs1058587)。我們進(jìn)一步對結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和其配對正常組織該位點(diǎn)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)部分病人的基因型存在不一致的情況，比如腫瘤組織的基因型為CG，而其配對正常組織的基因型為CC。鑒于這種基因型差異的現(xiàn)象發(fā)生在同一個病人的腫瘤組織和配對正常組織之間，所以我們認(rèn)為GDF1

6、5rs1058587不僅是一個多態(tài)性位點(diǎn)，而且還存在突變。rs1058587位于基因組的編碼序列上，它編碼的GDF15蛋白成熟體第六位氨基酸發(fā)生了組氨酸(H)和天冬氨酸(D)的轉(zhuǎn)換，因此又叫H6D多態(tài)性，該位點(diǎn)的突變稱之為H6D突變。這種GDF15 H6D多態(tài)性或其突變必然會導(dǎo)致GDF15蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)甚至功能發(fā)生改變。
　　基于上述工作基礎(chǔ)，我們設(shè)想，H6D多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生是否存在易感性，H6D多態(tài)性及其突變是否會影響到GDF

7、15的表達(dá)，是否與轉(zhuǎn)移和預(yù)后等臨床病理特征存在某種聯(lián)系，GDF15引起結(jié)直腸轉(zhuǎn)移的機(jī)制又是什么,本課題的研究目的就是要解決上述這些問題。
　　1. GDF15表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系以及轉(zhuǎn)移機(jī)制的探討
　　我們運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法對250例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中GDF15蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果證實(shí)GDF15的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期以及腫瘤芽數(shù)目正相關(guān)，并且GDF15高表達(dá)的患者預(yù)后差。
　　我

8、們體外模擬旁分泌途徑，運(yùn)用人重組GDF15蛋白對結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29、SW480及LS513進(jìn)行處理來探討GDF15引起結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　通過Transwell實(shí)驗證實(shí)，GDF15能夠促進(jìn)HT29細(xì)胞和SW480細(xì)胞的遷移。在隨后進(jìn)行的信號通路實(shí)驗中，我們發(fā)現(xiàn)，GDF15能使HT29和SW480細(xì)胞Smad2/3和磷酸化的smad2/3蛋白水平表達(dá)增加。并且，在HT29和LS513細(xì)胞中，Twist和MMP9蛋白表達(dá)升高

9、，E-cadherin蛋白表達(dá)下降;在SW480細(xì)胞中，Twist、MMP9和Vimentin蛋白表達(dá)升高，E-cadherin蛋白表達(dá)下降。以上結(jié)果表明，GDF15促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移是通過EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)過程來實(shí)現(xiàn)的。
　　為了進(jìn)一步驗證Twist等EMT標(biāo)志物表達(dá)的改變是否受Smad2/3的調(diào)控，我們運(yùn)用shRNA干擾技術(shù)在HT29細(xì)胞和SW480細(xì)胞中敲

10、低Smad2或Smad3的表達(dá)后，GDF15引起EMT標(biāo)志物表達(dá)改變的效應(yīng)能夠被逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果說明GDF15引起EMT標(biāo)志物表達(dá)的改變是受Smad2/3調(diào)控的。
　　GDF15是TGF-β超家族成員，而TGF-β是目前最常用于誘導(dǎo)EMT模型的細(xì)胞因子，這種誘導(dǎo)作用是通過激活Smad2/3來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)我們用GDF15作用于細(xì)胞后，Smad2/3也被激活。因此，我們設(shè)想，GDF15是否也是通過TGF-β通路參與了EMT過程，并引起細(xì)胞的

11、遷移。為了驗證這種假設(shè)，我們運(yùn)用TGF-β受體特異性抑制劑SB-431542預(yù)處理HT29、SW480及LS513細(xì)胞后，再用GDF15作用這些細(xì)胞，結(jié)果Smad2/3的表達(dá)沒有增高，E-cadherin的表達(dá)也沒有出現(xiàn)下降。另外，我們在SB-431542處理后的HT29和SW480細(xì)胞中用GDF15作用后，磷酸化Smad2/3的表達(dá)未見增高。這些結(jié)果說明GDF15引起EMT標(biāo)志物表達(dá)的改變是通過Smad依賴的TGF-β信號通路來完成的

12、。
　　2. GDF15 H6D多態(tài)性及其突變在結(jié)直腸癌臨床中的意義
　　我們運(yùn)用焦磷酸測序的方法對250例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和配對正常組織DNA以及198例正常人群血液DNA的GDF15 H6D多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，對獲得的數(shù)據(jù)與臨床病理特征及預(yù)后情況進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示:(1) H6D多態(tài)性及其突變與GDF15的表達(dá)未見明顯相關(guān)性。(2)GDF15 H6D多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生存在相關(guān)性，含有D等位基因的人群是結(jié)直腸

13、癌發(fā)病的易感人群。(3)結(jié)直腸癌中，GDF15 H6D存在突變，這種突變在CG基因型中更容易發(fā)生，有突變的患者死亡率比沒有突變的患者要高。(4)在男性結(jié)直腸癌中，GDF15 H6D發(fā)生突變的患者容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且預(yù)后差。(5)在結(jié)腸癌患者中，GDF15 H6D含D等位基因的患者容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這類患者死亡率高，純合的HH基因型預(yù)后好。(6)在直腸癌患者中，有H6D突變的患者容易引起淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高的TNM分期，最后導(dǎo)致死亡的比例增高。

14、
　　綜合以上GDF15在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制探討和GDF15表達(dá)、H6D及其突變在臨床中的意義的研究，我們得出以下結(jié)論:
　　GDF15促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，其表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)，表達(dá)高預(yù)后差。GDF15通過活化TGF-β信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。
　　GDF15 H6D多態(tài)性位點(diǎn)及其突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。D等位基因是結(jié)直腸癌的易感基因，并且與結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移正相關(guān)，D等位基因的病人