五株野生型芽孢桿菌表達載體的構(gòu)建分析.pdf

1、伴隨著水生動物病害的頻繁爆發(fā)，綠色、安全的微生物防控技術(shù)便成為了人們研究的熱點。有益菌在生物絮團中的應(yīng)用表現(xiàn)出其特有的應(yīng)用優(yōu)勢，而芽孢桿菌作為有益菌中的主要種類，現(xiàn)已然成為了科學(xué)家們研究的主要菌種。但現(xiàn)如今所研究的芽孢桿菌多為常見的標(biāo)準(zhǔn)菌株，因而，用于宿主菌的芽孢桿菌的種類較少，擴大芽孢桿菌的研究范圍是現(xiàn)如今亟待解決的問題。本實驗室從海水養(yǎng)殖蝦體腸道內(nèi)以及養(yǎng)殖水體中分離并保存有多種野生型有益芽孢桿菌，已經(jīng)證實其中一些芽孢桿菌對對蝦有保護

2、作用。
　　所用的五株野生型芽孢桿菌編號分別為PC004、201112010101、201112010603、201112010701、201112012401，進行16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，確定菌株的分類，分別為堅強芽孢桿菌(B.firmus)，蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，白翎芽孢桿菌(B.baekryungensis)，海水芽孢桿菌(B.aquimaris)；通過B

3、IOLOG分析儀對該五株芽孢桿菌進行了菌株的鑒定和碳源利用情況的分析；采用26種藥敏片對菌株進行系統(tǒng)的抗性分析，針對常用于抗性篩選的3種抗生素氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素進行了抗性分析，結(jié)果表明堅強芽孢桿菌PC004、201112010603菌株、201112012401菌株、201112010701菌株對氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素均敏感，201112010101菌株只對氯霉素敏感；天然質(zhì)粒的分析結(jié)果表明該五株野生型芽孢桿菌本身均不含

4、有天然質(zhì)粒。根據(jù)上述的初步分析結(jié)果可知堅強芽孢桿菌PC004、201112010603菌株、201112012401菌株、201112010701菌株均有成為宿主菌的潛力。
　　細(xì)菌研究試驗中經(jīng)常遇到菌體間的相互污染現(xiàn)象。細(xì)菌鞭毛蛋白編碼基因hag因其兩端序列的穩(wěn)定性和中間可變區(qū)的特性在細(xì)菌的分類和鑒定中可作為一種分子標(biāo)記。本研究根據(jù)枯草芽孢桿菌Bhag引物克隆得到了堅強芽孢桿菌hag基因1213bp。克隆所得序列與枯草芽孢桿菌的

5、hag基因序列的相似性為13％-15%。差異主要存在于堅強芽孢桿菌hag基因的中間可變區(qū)，并根據(jù)該序列設(shè)計套式引物Bfspecouter、Bfspecinner，建立了針對堅強芽孢桿菌PC004和PC024的套式PCR檢測方法。此外，還利用Bfspecinner實現(xiàn)了堅強芽孢桿菌的熒光定量PCR特異性檢測，檢測PC004的極限為17.3 CFU/ml，檢測PC024的極限為19.7 CFU/ml。本研究建立的堅強芽孢桿菌檢測方法特異性強

6、、操作周期短、靈敏度高，為該菌的實際應(yīng)用提供技術(shù)支持。
　　以pBE2質(zhì)粒為外源質(zhì)粒，五株芽孢桿菌作為受體菌分別應(yīng)用原生質(zhì)體法和電轉(zhuǎn)化法進行轉(zhuǎn)化分析。以pBE2質(zhì)粒作為外源質(zhì)粒用原生質(zhì)體法，實現(xiàn)外源質(zhì)粒向201112010101、201112010603菌株內(nèi)的轉(zhuǎn)化，但由于201112010101菌株本身的氨芐抗性會干擾抗性篩選，因此，本試驗最終選取201112010603菌株為pBE2質(zhì)粒的宿主菌，轉(zhuǎn)化時采用傳統(tǒng)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

7、。
　　實現(xiàn)外源質(zhì)粒的有效轉(zhuǎn)化后，針對該質(zhì)粒進行相關(guān)基因的改造試圖實現(xiàn)報告基因在枯草芽孢桿菌中的表達。
　　1、將pAD4412質(zhì)粒上的4412啟動子及gfpmut3a整合到pBE2質(zhì)粒上，構(gòu)建pBE4412質(zhì)粒;
　　2、將來源于枯草芽孢桿菌的P43強啟動子與GFP基因構(gòu)建成融合蛋白，與pBE2質(zhì)粒連接后構(gòu)建pBE43GFP質(zhì)粒;
　　3、由于GFP基因的表達在觀察上不夠直觀，將其更換為Cm基因，采用抗性平板篩

8、選方式判斷基因的表達情況，構(gòu)建 pBE43Cm質(zhì)粒;
　　4、將堅強芽孢桿菌的hag啟動子，與Cm基因構(gòu)建成融合蛋白后整合于pBEhCm質(zhì)粒;
　　5、4種新構(gòu)建的質(zhì)粒均采用原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)入芽孢桿菌中分析其表達情況。
　　愛德華氏菌三基因缺陷弱毒株作為宿主菌，采用電轉(zhuǎn)化法實現(xiàn)了本實驗室構(gòu)建的含VP28基因的pBAD-gIII質(zhì)粒向愛德華氏菌中的導(dǎo)入。用0.02%的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)含有pBAD-gIII質(zhì)粒的愛德華氏菌，經(jīng)