人野生型和突變型CITED2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建人轉(zhuǎn)錄輔助因子CITED2突變型(c.573-578de16)及野生型真核表達(dá)質(zhì)粒，將人轉(zhuǎn)錄輔助因子CITED2突變型(c.573-578de16)及野生型真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，并檢測兩組重組質(zhì)粒pEGFP-C1-mtCITED2和pEGFP-C1-wtCITED2中CITED2蛋白的表達(dá)情況。
　　方法：分別以健康兒童和CITED2基因雜合突變(c.573-578de16)的先天性心臟病患兒血細(xì)胞DNA為

2、模板，PCR定向克隆擴(kuò)增野生型CITED2和突變型CITED2基因的編碼鏈，分別T/A克隆連接到pMD19-Tsimple質(zhì)粒上，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選、菌液PCR、質(zhì)粒抽提后酶切及測序鑒定，篩選出野生型CITED2和突變型CITED2(c.573-578de16)的T載體重組質(zhì)粒。T載體重組質(zhì)粒上的CITED2基因片段分別酶切后膠回收目的基因CITED2，將兩組基因CITED2分別亞克隆入pEGFP-C1，構(gòu)建pEGFP-C1-wtC

3、ITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表達(dá)質(zhì)粒。將空載體pEGFP-C1(2ug)、pEGFP-C1-wtCITED2(2ug)和 pEGFP-C1-mtCITED2(2ug)分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，以空載體pEGFP-C1轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞組作為陽性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞組作為陰性對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染情

4、況;轉(zhuǎn)染后48小時(shí)運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測其轉(zhuǎn)染效率;Western blotting檢測兩組重組質(zhì)粒中CITED2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了pMD19-T-wtCITED2和pMD19-T-mtCITED2質(zhì)粒;
　　2.人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突變型pEGFP-C1-mtCITED2真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;
　　3.將空載體pEGFP-C1、pEGFP-C1-wtCITED2和p

5、EGFP-C1-mtCITED2分別成功轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞;
　　4.培養(yǎng)HEK293細(xì)胞至轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在熒光顯微鏡下可觀察到各轉(zhuǎn)染組EGFP的表達(dá)，陰性對(duì)照組的HEK293細(xì)胞中未觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá);
　　5.轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，以空白組細(xì)胞作為參照，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1、pEGFP-C1-wtCITED2和 pEGFP-C1-mtCITED2組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為50％-60％;運(yùn)用West

6、ern blotting檢測到CITED2蛋白與EGFP的融合表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了人轉(zhuǎn)錄輔助因子CITED2突變型及野生型CITED2真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　2.空載體pEGFP-C1、pEGFP-C1-wtCITED2和 pEGFP-C1-mtCITED2分別成功轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。
　　3.轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-wtCITED2組和 pEGFP-C1-mtCITED2組HEK293細(xì)胞分別檢